乳酸乳球菌BirA與bioY基因的結(jié)合
相對于近親豬鏈球菌的情況，由于存在birA和bioY的重復基因，bio基因座的基因組背景復雜（圖8A）。在bioY1啟動子區(qū)域前檢測到推定的BirA1 DNA結(jié)合位點（ACA GTT AAC CTA AAT TTG ATT TTA GGG TTA CTG T）（圖8B）。根據(jù)使用啟動子預測中性網(wǎng)絡程序預測的轉(zhuǎn)錄起始位點“T”的位置，BirA1結(jié)合位點似乎與“-10”到“-35”啟動子區(qū)域重疊（圖8B），表明bioY1的轉(zhuǎn)錄可能受乳酸乳球菌中BirA1負調(diào)控。
為了測試預測的BirA位點功能（圖8A和9A），進行了電泳遷移率變動分析（EMSA），使用純化的BirA1_LL和BirA2_LL（圖9B-D）。EMSA證實BirA1_LL以劑量依賴性方式有效結(jié)合bioY1探針（圖9B），而缺乏推定的N端DNA結(jié)合基序的BirA2_LL不結(jié)合探針（圖2和9C）。有趣的是，豬鏈球菌bioY（bioY_ss）啟動子能夠與乳酸乳球菌BirA1_LL相互作用（圖9D）。在豬鏈球菌BirA的情況下也發(fā)現(xiàn)了類似情況，它也能結(jié)合乳酸乳球菌bioY啟動子。因此，我們預期豬鏈球菌和乳酸乳球菌的bioY和BirA之間存在串擾。鑒于BirA1和bioY1啟動子之間發(fā)生相互作用，而bioY2缺乏預測的BirA1結(jié)合位點，探究這種調(diào)控機制與生物素同化的生理相關(guān)性可能很有意義。
乳酸乳球菌轉(zhuǎn)運H-生物素的能力
針對已解析的BioY結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)建模表明，BioY1_LL（圖10A）和BioY2_LL（圖10B）均由七個α-螺旋組成，并在整體構(gòu)型上表現(xiàn)出明顯相似性。鑒于乳酸乳球菌編碼兩個BioY轉(zhuǎn)運蛋白，我們假設它能夠進行強大的生物素轉(zhuǎn)運。乳酸乳球菌培養(yǎng)物在限制生物素或過量生物素（1 nM或1μM）存在下生長4.5小時，離心沉淀并用PBS洗滌以去除游離生物素，用于3H-生物素轉(zhuǎn)運測定（圖10C,D）。在測量時間間隔內(nèi)，生物素耗竭培養(yǎng)物（預測產(chǎn)生兩種BioY轉(zhuǎn)運蛋白）和生物素充足培養(yǎng)物（預測僅需單一轉(zhuǎn)運蛋白）的3H-生物素相對轉(zhuǎn)運相似。樣品之間的微小差異僅在初始轉(zhuǎn)運時間點觀察到（圖10D）。相反，在一分鐘及以后，生物素的攝取/積累大致相等（圖10C）。似乎測試的外源生物素增量并未顯著增強生物素攝取活性。
結(jié)論
本文報告的數(shù)據(jù)表明益生菌細菌乳酸乳球菌中存在特定的生物素利用途徑（圖1），與其近親動物病原體豬鏈球菌在birA和bioY基因座的冗余（和/或重復事件）上不同（圖8）。乳酸乳球菌預計是生物素營養(yǎng)缺陷型，因為它缺乏完整的生物素生物合成途徑。與豬鏈球菌中BirA調(diào)控bioY基因轉(zhuǎn)錄的生物素攝取調(diào)控機制不同，乳酸乳球菌有兩個負責生物素攝取的BioY轉(zhuǎn)運蛋白，和兩個催化蛋白質(zhì)生物素化的BPL酶（BirA1和BirA2_LL）。在兩個bioY基因（bioY1_LL和bioY2_LL）中，bioY1_LL的轉(zhuǎn)錄似乎受BirA1_LL調(diào)控，而bioY2_LL的表達是組成型的（圖1）。這種獨特機制可能確保乳酸乳球菌具有響應環(huán)境和/或胃腸道中波動生物素水平的能力。
據(jù)我們所知，細菌生物素代謝的調(diào)控至少通過三種不同機制發(fā)生，分別以大腸桿菌BirA、農(nóng)桿菌BioR和恥垢分枝桿菌BioQ為代表。調(diào)控的生物素轉(zhuǎn)運以布魯氏菌BioR22加上副球菌屬12和豬鏈球菌通過BirA為例。乳酸乳球菌中兩種不同功能性生物素蛋白連接酶的非典型出現(xiàn)增加了細菌生物素利用獨特實例的廣度（圖1）。在弗朗西斯菌屬中，我們也注意到兩個不同BirA直系同源物的非典型存在。然而，我們未能檢測到BioY轉(zhuǎn)運蛋白的直系同源物，排除了調(diào)控生物素轉(zhuǎn)運的可能性。與弗朗西斯菌屬中雙功能BirA蛋白在體外和體內(nèi)與大腸桿菌bio操縱子發(fā)生串擾的情況不同，乳酸乳球菌BirA1不能調(diào)控大腸桿菌bio操縱子的表達（注意：藍色是由于bio-lacZ融合的明顯表達，圖5）。值得注意的是，乳酸乳球菌BirA可以與豬鏈球菌bioY基因發(fā)生串擾（圖9D），反之亦然。與大腸桿菌情況一致，在乳酸乳球菌基因組中檢測到編碼生物素受體蛋白的accB基因（L0187）（表S1）。乳酸乳球菌兩個單獨BirA同源物相對于單個大腸桿菌BirA的BPL活性降低（圖6）可能表明BirA_LL的冗余是滿足乳酸乳球菌蛋白質(zhì)生物素化需求所必需的。乳酸乳球菌無法合成生物素以及胃腸道獨特生態(tài)系統(tǒng)（充滿各種營養(yǎng)元素和競爭細菌）可能選擇了生物素清除途徑的冗余，或者相反，基因組織可能只是細菌進化的遺跡。未來工作可以探索不同生物素條件下轉(zhuǎn)運蛋白產(chǎn)生的調(diào)控以及轉(zhuǎn)運蛋白效率的差異。
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