1.2.2菌株的初步鑒定
1.2.2.1形態(tài)學(xué)觀察
將菌株接種到固體培養(yǎng)基上，放置在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，肉眼觀察菌落的形狀、大小、隆起度、邊緣透明度與顏色等培養(yǎng)特征。在普通光學(xué)顯微鏡下難以看清細(xì)菌的形狀和結(jié)構(gòu)，因此，需要通過(guò)革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色和鞭毛染色等方法，將菌體染上顏色，從而借助顏色的反差作用觀察菌體形態(tài)。經(jīng)染色后利用光學(xué)顯微鏡觀察革蘭氏染色、形狀、莢膜、芽孢以及鞭毛等菌體形態(tài)。
1.2.2.2生理生化鑒定
主要選擇了糖或醇類發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖)、溫度生長(zhǎng)范圍、pH生長(zhǎng)范圍、需氧性試驗(yàn)、硝酸鹽還原、吲哚試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、明膠水解、酪素水解、淀粉水解、酪氨酸水解、耐鹽性試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶的測(cè)定、卵磷脂酶的測(cè)定、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、石蕊牛奶反應(yīng)、溶菌酶抗性試驗(yàn)以及在pH 5.7的營(yíng)養(yǎng)肉湯上的生長(zhǎng)等19項(xiàng)試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，具體試驗(yàn)方法參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》。
1.2.3細(xì)菌16S rDNA鑒定
將細(xì)菌16S rDNA鑒定的通用引物作為上下游引物，以提取的菌株總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 13.7μL，10×Ex Taq buffer 2.0μL，5u Ex Taq 0.2μL，2.5mM dNTP Mix 1.6μL，上游引物(5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′)1μL，下游引物(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)1μL，DNA模板0.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，該步驟循環(huán)25次，最后72℃延伸10 min，于4℃冰箱保存。在進(jìn)行DNA測(cè)序之前，檢測(cè)PCR是否擴(kuò)增成功。取2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，用凝膠成像儀檢測(cè)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。利用BLAST軟件，將測(cè)得的序列與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)MEGA6.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
1.2.4生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
細(xì)菌的生長(zhǎng)要經(jīng)過(guò)遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期四個(gè)階段。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌生長(zhǎng)速率最快，對(duì)碳源的利用率也最高。因此，測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的菌種制備成種子液，用于苯酚降解實(shí)驗(yàn)。挑取兩個(gè)單菌落接種到富集培養(yǎng)基中，32℃、180 r/min放入全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀振蕩培養(yǎng)30 h。以未接種的富集培養(yǎng)基做空白對(duì)照，在600 nm波長(zhǎng)下，每四小時(shí)測(cè)定OD值，以檢測(cè)細(xì)菌濃度。為減少誤差，取兩組平行實(shí)驗(yàn)的平均值繪制生長(zhǎng)曲線。
1.2.5菌株的降酚特性
將平板上的單個(gè)菌落接種到富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成菌懸液。篩選菌株Y_1時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌在苯酚濃度1 100 mg/L時(shí)能良好生長(zhǎng)。因此，將菌株在苯酚濃度1 100 mg/L、pH 7.0～7.2、接種量4%、溫度32℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，以不含苯酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為空白對(duì)照，采用4-氨基安替吡啉直接分光光度法[34]測(cè)定苯酚濃度。在相同條件下進(jìn)行三組平行試驗(yàn)，取三組讀數(shù)的平均值。依據(jù)苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出苯酚的降解率。
苯酚降解率計(jì)算公式：苯酚降解率=(接種前的苯酚濃度-生長(zhǎng)消耗剩余的苯酚濃度)/接種前的苯酚濃度×100%
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