討論
雙組分調(diào)控系統(tǒng)是廣泛存在的原核信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，允許細胞響應不斷變化的環(huán)境來調(diào)節(jié)其功能。盡管關于各種細菌物種中雙組分系統(tǒng)的鑒定和表征的信息越來越多，但對其在變形鏈球菌（齲齒的主要病原菌）中的作用知之甚少。基因組分析揭示了幾個相關革蘭氏陽性生物（如肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、芽孢桿菌屬等）中存在許多推定的TCSTS。通過基因組分析，我們最近描述了變形鏈球菌中13個獨立的TCSTS，并構建了編碼這些系統(tǒng)的26個基因的25個單獨突變體（Lau and Cvitkovitch,摘要）。由于我們的主要興趣之一是鑒定參與變形鏈球菌毒力因子表達的TCSTS，我們專注于篩選與生物膜形成、酸耐受性以及其他環(huán)境應激（包括乙醇、月桂基硫酸鈉（牙膏中常見）和H?O?）相關的突變體表型。
我們實驗室先前的工作描述了一個由雙組分調(diào)控系統(tǒng)（ComDE）組成的群體感應信號系統(tǒng)，該系統(tǒng)先前被證明影響變形鏈球菌的遺傳感受態(tài)、生物膜形成和ATR。在本研究中，我們提供的證據(jù)表明，一個新的雙組分調(diào)控系統(tǒng)HK/RR11在變形鏈球菌中作為生物膜形成和酸耐受性表型的決定因素起著重要作用。
我們的結(jié)果清楚地表明，刪除hk11或rr11會導致形成生物量減少且具有海綿狀結(jié)構的生物膜（圖3和4）。通過SEM觀察到一個顯著特征是，與具有更連續(xù)外觀的親本生物膜相比，突變體生物膜似乎由許多大的細胞間通道組成。由于生物膜中的水通道促進了生物膜和主體液相之間的底物交換，因此hk/rr11突變體生物膜可能在運輸?shù)孜锘蚯宄x終產(chǎn)物方面存在缺陷。
另一項由Bhagwhat等人進行的研究檢查了六個TCSTS的應答調(diào)節(jié)蛋白缺陷的變形鏈球菌突變體。該研究中描述的一個突變體與RR11突變體（tceK）類似，并且也檢測了其形成生物膜的能力。然而，Bhagwhat小組沒有描述該突變體存在生物膜形成缺陷。值得注意的是，親本菌株以及生長和測定條件與我們的不同。但是，我們關于rr11缺失不影響遺傳感受態(tài)的觀察與Bhagwhat等人的觀察結(jié)果一致。然而，這些研究人員確實發(fā)現(xiàn)，失活tcbR（編碼ComD/ComE TCSTS的應答調(diào)節(jié)蛋白的comE基因）導致生物膜形成減少10倍，這與我們之前的發(fā)現(xiàn)一致，即comD和comE突變體形成有缺陷的生物膜，且生物量減少。
與親本菌株相比，SMHK11和SMRR11生物膜都具有海綿狀結(jié)構，由組織成非常長鏈的細胞組成，這是我們之前在使用無法產(chǎn)生信號肽信息素CSP的comC突變體形成的生物膜中觀察到的特征。然而，有缺陷的comD或comE突變體并不具有網(wǎng)狀或海綿狀結(jié)構，這表明存在一個單獨的途徑對CSP有反應。為了進一步支持第二個CSP傳感器系統(tǒng)的存在，我們發(fā)現(xiàn)外源添加CSP或用野生型comC基因補充comC突變體可部分恢復comCDE突變體生物膜的野生型表型。由于該突變體在產(chǎn)生CSP及其同源受體（由comD編碼）方面存在缺陷，我們假設存在另一個識別CSP并參與細胞分裂或分離的受體，最終影響生物膜結(jié)構。
由于我們懷疑由hk/rr11編碼的TCSTS可能作為第二條途徑起作用，我們向突變體培養(yǎng)物中添加CSP，以評估對hk11和rr11突變體生物膜細胞鏈形成的影響。結(jié)果顯示，向突變體培養(yǎng)物中添加CSP對組成突變體生物膜的鏈長度沒有可觀察到的影響（數(shù)據(jù)未顯示）。這一結(jié)果與HK11作為CSP受體的作用一致，但并未提供直接證據(jù)來最終確定HK11作為CSP受體的作用。有必要對CSP與hk/rr11系統(tǒng)的相互作用進行更仔細的研究。
Wen和Burne最近描述了一個基因，命名為brpA（生物膜調(diào)節(jié)蛋白），它編碼變形鏈球菌UA159中的一個406個氨基酸的蛋白質(zhì)。他們的工作還表明，brpA的失活導致產(chǎn)生異常生物膜的菌株，該突變體形成的鏈比親本菌株更長。盡管這里清楚地觀察到了相同的表型，但目前沒有數(shù)據(jù)將BrpA介導的效應與HK/RR11系統(tǒng)聯(lián)系起來。未來的研究將有必要檢查HK/RR11系統(tǒng)、brpA和comCDE群體感應系統(tǒng)之間可能的相互作用。
由于我們懷疑hk/rr11基因可能編碼一個肽感應系統(tǒng)，我們搜索了該區(qū)域是否存在編碼包含潛在雙GG切割位點（分泌信號肽的典型特征）的小ORF，但未能鑒定出任何候選基因。周圍基因的推定功能并不暗示它們在遺傳感受態(tài)、生物膜形成或酸耐受性中具有明顯作用。盡管這些鄰近基因在當前與CSP反應相關的表型中似乎沒有明顯作用，但它們可能有助于在生物膜或高細胞密度環(huán)境中的最佳存在。例如，最近證明肺炎鏈球菌中編碼丙酮酸甲酸裂解酶激活酶的pflC基因被肺炎鏈球菌CSP系統(tǒng)激活，而該基因與遺傳感受態(tài)沒有明顯關系。編碼丙酮酸甲酸裂解酶激活酶的pflC基因與hk/rr11基因非常接近；研究這些基因之間的聯(lián)系將會很有趣，因為在變形鏈球菌中，丙酮酸甲酸裂解酶對氧極度敏感，并且可能在厭氧生物膜中的高細胞密度下發(fā)揮最佳功能。
另一個有趣的觀察是，hk11突變體（SMHK11）在酸耐受性方面顯著受損。SMHK11在低pH下的生長和適應信號pH（pH 5.5）后對酸殺滅的抵抗力方面都存在缺陷。這表明由hk11編碼的膜相關蛋白可能作為pH傳感器，參與激活據(jù)信影響變形鏈球菌酸耐受表型的眾多途徑之一。已有研究表明TCSTS可作為pH傳感器：最著名的是根瘤菌的actSR和單核細胞增生李斯特菌的lisRK，它們對于誘導適應性ATR至關重要。有趣的是，只有SMHK11表現(xiàn)出酸敏感性，因為我們在刪除rr11基因時沒有觀察到相同的表型效應。直觀上，人們會期望編碼TCSTS的任一基因的失活或缺失都會產(chǎn)生相似的表型，因為組氨酸激酶受體或其同源應答調(diào)節(jié)蛋白的缺陷可能會阻礙輸入信號激活由應答調(diào)節(jié)蛋白控制的基因和途徑。然而，在我們的研究中，SMHK11和SMRR11具有不同表型的觀察結(jié)果表明，相關受體之間可能存在交叉對話，其中hk/rr11系統(tǒng)的組氨酸激酶傳感器蛋白可以將pH信號傳遞給一個或多個非同源應答調(diào)節(jié)蛋白。這種現(xiàn)象稱為體內(nèi)交叉對話，最近由Verhamme等人描述，他們通過體內(nèi)方法證明了大腸桿菌中四個關鍵雙組分系統(tǒng)之間的相互作用。他們的結(jié)果表明，傳感器激酶的功能性組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移結(jié)構域似乎是生理交叉對話中的積極參與者。需要進一步的研究來鑒定在SMRR11中通過HK11傳感器蛋白發(fā)生的交叉對話中涉及的推定應答調(diào)節(jié)蛋白。
SMHK11和NG8的2D圖譜比較顯示，14個酸誘導（和抑制）蛋白質(zhì)在突變體和親本之間是保守的（表3）。然而，SMHK11有四個在NG8中可見的蛋白質(zhì)在突變體中未檢測到。其中之一，1008號蛋白質(zhì)，可能是組氨酸激酶HK11本身，其在30 kDa處遷移，pI為5.5。從HK11的推導蛋白質(zhì)序列獲得的值如下：計算分子量為38,113 Da，估計pI為5.71。另一個在SMHK11中未被誘導的有趣蛋白質(zhì)是87號點，它代表一種外切多磷酸酶。多磷酸代謝已與許多細菌（包括變形鏈球菌）的生物膜形成相關聯(lián)。多磷酸可能提供了應對生物膜生長過程中遇到的環(huán)境波動所需的快速能源。
在rr11的5'端附近鑒定出與肺炎鏈球菌的com-box驚人相似的啟動子樣結(jié)構是引人入勝的。在CSP限制和誘導條件下研究rr11的表達可能有助于破譯變形鏈球菌的com-box。我們已經(jīng)在變形鏈球菌基因組中發(fā)現(xiàn)的晚期感受態(tài)直系同源物附近鑒定出了類似的結(jié)構。推導變形鏈球菌的com-box可能加快我們解開這個調(diào)節(jié)子的速度，因為它將允許我們通過計算機分析鑒定候選基因。對CSP介導的及其他參與生物膜表型表達的基因的理解將有望使我們發(fā)現(xiàn)控制問題生物膜的方法。
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