由于耐藥突變體可以從極低初始比例（10??）富集，我們還測試了耐藥突變體是否可以從敏感群體新發(fā)選擇。為此，我們在鏈霉素最小抑制濃度的1/4下生長鼠傷寒沙門氏菌LT2敏感野生型菌株的20個獨(dú)立譜系700代，并通過在不同鏈霉素濃度上鋪板連續(xù)篩選耐藥細(xì)胞。在此低抗生素水平下，我們觀察到新發(fā)耐藥突變體的快速富集（圖5）。因此，在200至400代內(nèi)，可以看到耐藥性在起始菌株最小抑制濃度的2至16倍（8-64μg/ml）之間的突變體顯著富集，并在500至600代后出現(xiàn)高水平耐藥突變體（野生型最小抑制濃度的24-32倍=96-128μg/ml）。400代后，所有20個譜系包含最小抑制濃度高于32μg/ml（8倍最小抑制濃度）的亞群體，600代后，14個譜系有最小抑制濃度高于64μg/ml（16倍最小抑制濃度）的亞群體。使用上述方法，在環(huán)丙沙星亞最小抑制濃度水平下生長大腸桿菌野生型的20個譜系600代。在最小抑制濃度的1/10下生長500代后，五個譜系有對環(huán)丙沙星低水平耐藥（最小抑制濃度比敏感親本菌株高2倍）的亞群體（>1%群體），600代后，二十個譜系中有一個譜系有最小抑制濃度比敏感親本菌株高8倍的細(xì)胞亞群體。
我們還計算了（文本S1中的附錄）新發(fā)耐藥突變體在低抗生素濃度下接管敏感群體的速度，由突變率（u）、群體大?。∟）和抗生素存在下的適應(yīng)性優(yōu)勢（s）決定。s取決于高于MSC的抗生素濃度，如圖2和3所示。當(dāng)無耐藥突變體初始存在時，固定時間可表達(dá)為
第一項(xiàng)是第一個存活突變體出現(xiàn)的隨機(jī)等待時間，第二項(xiàng)是隨后增長至50%存在的時間。對于小值uN<0.1，第一項(xiàng)主導(dǎo)，固定可能慢。對于大值uN>1，第二項(xiàng)主導(dǎo)，固定可快，約100-1000代，s在0.1-0.01之間（圖6）。在此背景下，值得注意的是幾種抗生素的亞最小抑制濃度水平，最顯著為氟喹諾酮類，已顯示增加細(xì)菌突變率，可能減少等待時間從而增加突變體接管速率。
討論
自然環(huán)境中抗生素濃度可廣泛變化，取決于特定環(huán)境。例如，在污染制藥工業(yè)或醫(yī)院污水出口處，濃度可達(dá)到極高水平（mg/ml），氟喹諾酮類常達(dá)最高水平，而在水體或土壤中水平通常低得多。本文數(shù)據(jù)表明，即使在那些抗生素濃度極低的環(huán)境中，耐藥細(xì)菌的維持和選擇也可能發(fā)生。例如，我們實(shí)驗(yàn)獲得的環(huán)丙沙星和四環(huán)素的MSC對應(yīng)100 pg/ml和15 ng/ml，分別類似于某些水體和土壤環(huán)境中可發(fā)現(xiàn)的濃度。因此，在相對原始環(huán)境動物中發(fā)現(xiàn)的高頻率抗生素耐藥細(xì)菌可部分由亞最小抑制濃度選擇效應(yīng)富集解釋。
這些發(fā)現(xiàn)也與耐藥性可逆性問題高度相關(guān)。由于大多數(shù)抗生素耐藥機(jī)制與適應(yīng)性成本相關(guān)，有人提出如果抗生素選擇壓力降低，敏感細(xì)菌將超過耐藥細(xì)菌。然而，大多數(shù)可用數(shù)據(jù)表明在社區(qū)水平可逆性速率慢或不存在。幾種因素可能促成這種不可逆性，包括無適應(yīng)性成本、通過補(bǔ)償突變減少適應(yīng)性成本以及耐藥基因與另一受選擇基因之間的遺傳共選擇。此外，本文觀察到的亞最小抑制濃度選擇可能是這種耐藥性長期持久性的重要貢獻(xiàn)者，環(huán)境中極低抗生素濃度足以通過進(jìn)一步平衡耐藥性的適應(yīng)性成本來維持群體中現(xiàn)有耐藥細(xì)菌。這對于正常生命周期涉及在土壤環(huán)境中生長（如銅綠假單胞菌）或周期性在水體環(huán)境中生長（如大腸桿菌）的細(xì)菌病原體尤其重要。
從圖2B、D和圖3B、D、F、H中圖的斜率我們可以推斷耐藥突變體的適應(yīng)性成本對MSC值有主要影響。此成本必須首先由抗生素對敏感細(xì)菌的負(fù)面影響克服，耐藥細(xì)菌才會被選擇，使MSC向更高濃度移動。減少此成本將使曲線上移并降低MSC。同樣明顯的是突變體增加的耐藥性（敏感最小抑制濃度和耐藥最小抑制濃度之間的差異）或耐藥模式（點(diǎn)突變或外排泵）對MSC的影響相對于適應(yīng)性成本較小。由于我們的數(shù)據(jù)在明確遺傳背景中獲得，具有針對測試抗生素常見的單點(diǎn)突變或缺失，適應(yīng)性成本代表新發(fā)耐藥突變的成本。然而，在大多數(shù)臨床發(fā)現(xiàn)的耐藥菌株中，耐藥性的適應(yīng)性成本常通過次級突變補(bǔ)償而不喪失耐藥性。這種適應(yīng)性補(bǔ)償已針對許多不同抗生素的耐藥性描述，包括氟喹諾酮類和鏈霉素。這意味著此類補(bǔ)償耐藥菌株將被選擇的抗生素濃度可能比我們此處測量的更低。
我們及他人發(fā)現(xiàn)的另一重要含義是廣泛使用的突變體選擇窗口概念需要修改。因此，在藥效學(xué)中通常假設(shè)低于最小抑制濃度的抗生素濃度不賦予選擇，且突變體選擇窗口——耐藥突變體被富集的濃度范圍——延伸在敏感野生型最小抑制濃度和耐藥突變體最小抑制濃度之間。然而，我們的結(jié)果暗示生物學(xué)相關(guān)的亞最小抑制濃度選擇窗口更寬，需要包括敏感最小抑制濃度數(shù)百倍以下的抗生素濃度（圖1A）。此外，本文描述的方法論可用于探測不同環(huán)境中生物學(xué)活性抗生素濃度，包括例如動物模型。因此，通過在用不同抗生素濃度處理的動物中進(jìn)行遺傳標(biāo)記敏感和耐藥菌株之間的競爭，可以從耐藥細(xì)菌富集速率推斷細(xì)菌生長位點(diǎn)的生物學(xué)活性抗生素濃度。
在菌株最小抑制濃度以上選擇時，選擇的主要驅(qū)動力是抗生素耐藥性，而突變的適應(yīng)性成本較不重要。即使成本非常高的突變也會被選擇，因?yàn)槊舾屑?xì)菌形式的競爭者將被消除。然而，在亞最小抑制濃度水平下，情況不同，因?yàn)槊舾屑?xì)菌不會死亡，只會生長更慢。因此，賦予高適應(yīng)性成本的耐藥突變不會被富集；只有適應(yīng)性成本低于抗生素在敏感細(xì)菌中引起的生長減少的突變才具有競爭力。這表明在此類條件下可能富集新的低成本或無成本耐藥突變譜系。圖5數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)有耐藥突變體的濃度，但它們也可以從敏感群體新發(fā)選擇耐藥突變體。有趣的是，盡管使用低抗生素濃度，高水平耐藥突變體被富集。由于用于新發(fā)突變體選擇的鏈霉素濃度與野生型和rpsL K42R突變體競爭確定的MSC相同，富集的耐藥細(xì)菌很可能攜帶適應(yīng)性成本顯著低于先前研究的rpsL突變的耐藥突變。
在呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中，預(yù)存突變體在與敏感菌株競爭中快速富集。從數(shù)學(xué)模型我們可以推斷新發(fā)耐藥突變體的類似情況，尤其是在大群體中uN>1且抗生素濃度0.01<s<1.0時。在這些情況下，耐藥突變體快速出現(xiàn)，并在100-1000代生長內(nèi)接管群體。模型得到圖5和圖S2所示實(shí)驗(yàn)支持，其中新發(fā)突變體在亞最小抑制濃度抗生素存在下生長600-700代期間頻率持續(xù)增加。
總之，本文數(shù)據(jù)表明許多自然環(huán)境中存在或治療期間在某些體腔室中產(chǎn)生的極低抗生素水平與預(yù)存耐藥突變體的富集和維持以及新突變體的新發(fā)選擇相關(guān)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)引入減少環(huán)境中抗生素水平和使用避免長時間亞最小抑制濃度抗生素水平的治療劑量方案的重要性。
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