摘要：為了探明一株沙福芽胞桿菌（Bacillus safensis）的生長與產(chǎn)碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）特性，采用單因素實(shí)驗(yàn)，研究了培養(yǎng)基初始pH、接種量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速及Zn2?、Co2?、Cd2?、Mn2?、Mg2?、Ca2?等金屬離子對細(xì)菌生長及其產(chǎn)CA活性的影響。結(jié)果表明，該菌株的最佳生長條件和產(chǎn)CA的最佳條件不同。30℃時，細(xì)菌生長最快，45℃時酶活性最高；細(xì)菌進(jìn)入衰亡期酶活性達(dá)到最高。胞內(nèi)外總CA檢測結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)胞內(nèi)CA。加入0.010 mmol/L Mn2?，酶活性達(dá)2.46 U/mL，比對照組提高了2.6倍。
碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）是一種以鋅為活性中心的金屬酶，廣泛分布于動物、植物和微生物中。CA可以高效催化CO?和HCO??之間的相互轉(zhuǎn)化，已在強(qiáng)化CO?捕集、利用及封存（Carbon Capture,Utilization and Storage,CCUS），驅(qū)動巖溶系統(tǒng)碳循環(huán)，修復(fù)水泥基和石質(zhì)文物表面裂縫以及加固砂土等領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。目前使用的產(chǎn)CA細(xì)菌大多是從巖溶土壤或水體中分離篩選出的，其中包括巴氏芽胞桿菌（Bacillus pasteurii）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）和膠凍樣芽胞桿菌（Bacillus mucilaginosus）等。
這些桿菌對高濃度CO?有較強(qiáng)的耐受性，且產(chǎn)CA的能力強(qiáng)。Kaur等從印度堿土中分離出一株巨大芽胞桿菌（B.megaterium SS3），研究了pH對其生長和產(chǎn)CA的影響，結(jié)果表明，pH值為10.0時細(xì)菌生物量最大且CA活性最高，培養(yǎng)時間為96 h時酶活性最高。楊清清等以一株芽胞桿菌為出發(fā)菌株，研究了pH和溫度對細(xì)菌生長和CA活性的影響，結(jié)果表明，細(xì)菌生物量最大和酶活性高的最佳培養(yǎng)條件為pH值6.0~7.0、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間32 h。Jaya等從海洋水樣中篩選出一株產(chǎn)碳酸酐酶細(xì)菌（Bacillus safensis AS-75），通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了pH、溫度、Zn2?濃度及NaCl含量對其產(chǎn)CA活性的影響，結(jié)果表明，在培養(yǎng)基pH值9.0、4%（體積分?jǐn)?shù)）NaCl、10 mmol/L Zn2?及培養(yǎng)溫度32℃條件下，細(xì)菌分泌的CA活性高。李為等從西南巖溶生態(tài)系統(tǒng)分離出一株芽胞桿菌（GRT102Ca），研究了溫度、pH、金屬離子和陰離子對細(xì)菌CA活性的影響，結(jié)果表明，在20~30℃和pH值7.2時，胞外酶活性較高，1.0 mg/L Zn2?、0.1 mg/L Co2?、100 mg/L Ca2?和80 mg/L Mg2?均能不同程度地增強(qiáng)CA活性。易哲等從喀斯特地貌中分離出一株芽胞桿菌，研究了溫度、pH、金屬離子、陰離子對其CA活性的影響。結(jié)果顯示，細(xì)菌CA在pH值為7.0~8.5、溫度10~40℃時活性高，F(xiàn)e2?和Zn2?在濃度低于0.01 mmol/L時能增強(qiáng)CA活性，而Ca2?和Mg2?對CA活性有抑制作用。
為了獲得高活性的微生物CA，必須探明微生物的生長和產(chǎn)酶特性。本研究以一株沙福芽胞桿菌（Bacillus safensis）為供試菌株，研究了培養(yǎng)基初始pH、接種量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速及Zn2?、Co2?、Cd2?、Mn2?、Mg2?、Ca2?離子對其生長和產(chǎn)CA活性的影響，以確定其最佳培養(yǎng)條件，為進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株
菌株購自北納生物微生物菌種保藏中心，經(jīng)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司通過16S rDNA序列鑒定，表明該菌株與沙福芽胞桿菌（Bacillus safensis）的同源性達(dá)99%。
1.1.2培養(yǎng)基
營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基）：牛肉膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L；營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（平板培養(yǎng)基）：液體培養(yǎng)基中加入瓊脂15.0 g/L。
1.1.3試劑與儀器
細(xì)菌細(xì)胞裂解液：B-PER?Bacterial Cell Lysis Reagents（Thermo Fisher Scientific）。雷磁pH計（PRS-3G，上海儀電科學(xué)儀器有限公司）；Bio Photometer核酸蛋白檢測儀（德國，艾本德）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZQZY-78AV，上海知楚儀器有限公司）；高壓滅菌鍋（GI54DWS，致微儀器有限公司）；全自動酶免分析儀（Synergy LX，BioTek Instruments Inc.）。
1.2方法
1.2.1菌懸液的制備
在超凈工作臺內(nèi)，挑取一環(huán)平板培養(yǎng)基上的單菌落接種于100 mL液體培養(yǎng)基中。30℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)12 h后，取2 mL菌液于100 mL液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)6 h，用液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液OD???為0.5（Cell/mL=2.25×10?），作為備用菌懸液。
1.2.2菌液OD???檢測
在超凈工作臺內(nèi)，取2 mL菌液，用液體培養(yǎng)基稀釋3倍后在蛋白核酸測定儀上測定其OD???值，平行測定3次，結(jié)果取平均值。
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