(ii)非熱滅活實(shí)驗(yàn)
生成了一個(gè)新的包含96條非熱滅活曲線的數(shù)據(jù)集，其中a_w是抑制因子，在所有可能的幾種溫度（12、16、21和25°C）、pH值（4、5和6）、a_w值（0.90和0.94）和乳酸濃度（5,000、10,000、20,000和45,000 ppm）組合下進(jìn)行。TSB根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)并在接種約10^8 CFU/ml的大腸桿菌O103:H25或大腸桿菌O157:H7前保持在目標(biāo)溫度。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔，樣品鋪板于胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA;Oxoid）；平板在37°C培養(yǎng)48小時(shí)。選擇延長的培養(yǎng)時(shí)間而不是傳統(tǒng)的24小時(shí)，是因?yàn)?7°C可能不是應(yīng)激細(xì)菌恢復(fù)和后續(xù)菌落形成的最適溫度。盡管有此預(yù)防措施，絕對(duì)菌落計(jì)數(shù)可能受到影響。然而，假設(shè)恢復(fù)環(huán)境對(duì)滅活過程所有采樣時(shí)間的絕對(duì)計(jì)數(shù)具有相同影響，因此種群滅活速率的估計(jì)不應(yīng)受恢復(fù)條件的顯著影響。但這未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，可能是細(xì)菌滅活復(fù)雜性和缺乏線性的原因之一。
(iii)生長/無生長實(shí)驗(yàn)
生成了兩個(gè)新的數(shù)據(jù)集。第一個(gè)數(shù)據(jù)集用于評(píng)估在288種條件下生長的能力，這些條件由幾種溫度（10、16和20°C）、pH值（4.8、5.1、5.4、5.7、6.0和6.3）、a_ws（0.94、0.95、0.96和0.97）和乳酸濃度（5,000、10,000、20,000和45,000 ppm）組合而成。TSB經(jīng)調(diào)節(jié)并設(shè)定至目標(biāo)溫度。將225μl體積分裝到Bioscreen微孔板中，并用25 ul 100倍稀釋的大腸桿菌O103:H25接種。在第二個(gè)數(shù)據(jù)集中，評(píng)估了大腸桿菌在144種條件下生長的能力，這些條件由更寬的溫度范圍（10、16、20和25°C）和更高的a_ws（0.96和0.99）與第一個(gè)數(shù)據(jù)集相同的pH值和乳酸濃度組合而成。TSB按上述制備，并用25μl等量混合的100倍稀釋的大腸桿菌O103:H25培養(yǎng)物和100倍稀釋的大腸桿菌O157:H7 218培養(yǎng)物接種。
板邊緣用250μl無菌TSB或225μl TSB接種25μl 100倍稀釋的大腸桿菌填充，以跟蹤TSB中的正常生長。在接種時(shí)以及隨后每天在600 nm下進(jìn)行光密度測量（Bioscreen C生長曲線分析儀），持續(xù)最多33天。將微孔板儲(chǔ)存在塑料盒中以避免液體蒸發(fā)，并在目標(biāo)溫度下培養(yǎng)。每個(gè)菌株和環(huán)境條件組合至少記錄兩個(gè)重復(fù)。
(iv)在中試工廠制造FRMS
香腸生產(chǎn)在生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，如先前所述。使用的“挪威香腸”配方如下（每公斤克數(shù)）：牛肉378.5；豬肉378.5；豬背脂肪200；葡萄糖40；亞硝酸鈉0.08；抗壞血酸0.5；香腸香料（商業(yè)預(yù)混料）3。按制造商說明添加LS-25 Starter培養(yǎng)物（Gewurzmiller,Germany）。切碎和混合后，在灌裝到纖維腸衣（直徑70 mm）制成約500至700克的香腸前，將約10^8 CFU/g的大腸桿菌O157:H7 218Rif與Starter培養(yǎng)物輕輕混合。為了覆蓋所有采樣（每次采樣1根香腸），每批至少制作10根香腸。灌裝時(shí)肉糜溫度為-2至0°C。香腸在環(huán)境溫濕度下調(diào)節(jié)約2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到氣候室。氣候室中的溫度和相對(duì)濕度（RH）方案如下：24°C和94%RH下3天，18°C和85%RH下3天，17°C和81%RH下4天，以及15°C和75%RH下17天（表1）。通過自動(dòng)溫度記錄裝置（Termometerfabriken Viking AB,Eskilstuna,Sweden）監(jiān)測香腸內(nèi)部溫度。對(duì)于上述方案的四個(gè)階段，實(shí)際內(nèi)部溫度平均分別為24.2°C、18.6°C、17.0°C和14.2°C，偏差為±0.4°C。
代表典型“瑞典mettwurst”型香腸的肉糜直接從瑞典香腸工廠冷凍交付（未提供確切配方）。
如上述所述，在灌裝和稱重前，將大腸桿菌O157:H7 218Rif和Starter培養(yǎng)物（FSC 111;Chr.Hansen A/S,Denmark）混合到肉糜中。氣候室中的溫度和RH方案為：19至21°C和40至50%RH下24小時(shí)，22°C和70%RH下3天，20°C和60%RH下2天，以及16°C和60%RH下4天（表1）。實(shí)際內(nèi)部溫度平均分別為20°C、22.4°C、20.7°C和15.7°C±0.4°C。成品香腸真空包裝并在4°C黑暗儲(chǔ)存。
為了研究發(fā)酵溫度和儲(chǔ)存條件的影響，用約10^7 CFU/g等量混合的大腸桿菌O157:H7 218Rif和大腸桿菌O103:H25 Rif接種挪威香腸。溫度方案為24°C或34°C下3天，18°C下3天，17°C下7天，以及15°C下7天（表1）。成品真空包裝并在不同溫度（12、16、21或25°C）下儲(chǔ)存最多66天（表1）。
在適當(dāng)?shù)牟蓸訒r(shí)間，取出一整根香腸；將10克香腸中段與90毫升0.4%蛋白水在拍擊式均質(zhì)器中混合。使用Aqualab儀器（Decagon Devices,Pullman,WA）根據(jù)制造商說明分析水分活度。在拍擊式均質(zhì)器的水相中測量pH值。乳酸濃度由商業(yè)分析實(shí)驗(yàn)室（Eurofins Norge,Moss,Norway）測定。樣品鋪板于含有100μg/ml利福平（Sigma-Aldrich,Norway）的TSA平板（Oxoid）上。
(v)參數(shù)估計(jì)
需要時(shí)，通過將Baranyi和Roberts模型擬合生長曲線來估計(jì)最大比生長速率，而熱和非熱比滅活速率則從滅活曲線線性部分的斜率估計(jì)，該曲線表示為濃度自然對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間的關(guān)系。
在溫度大于約47°C時(shí)，溫度本身對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出致死效應(yīng)，并且溫度對(duì)大腸桿菌滅活的影響發(fā)生急劇變化，這需要開發(fā)熱滅活模型。因此，開發(fā)了一個(gè)熱滅活模型來描述溫度對(duì)大腸桿菌的致死效應(yīng)。為此，將ComBase中報(bào)告的49°C至55°C溫度范圍和pH 7下測量的38個(gè)熱滅活速率與薩拉米香腸在相同溫度和pH下報(bào)告的結(jié)果進(jìn)行了比較。在后者的研究中，在49至62°C之間的幾種熱處理下，大腸桿菌O157:H7在pH 4.4和4.8的pepperoni中的響應(yīng)被量化。在pH 4.8的薩拉米香腸中觀察到最大的耐熱性。該數(shù)據(jù)集用于擬合熱滅活模型參數(shù)（表2）。
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