結(jié)果
分子鑒定
5株分離株的T3B PCR指紋圖譜顯示300至800 bp的DNA片段，通過(guò)與巴西孢子絲菌模式菌株獲得的圖譜相似性可以進(jìn)行清晰鑒定（圖2）。此外，來(lái)自所有患者分離株的圖譜呈現(xiàn)100%相似性。
基本局部比對(duì)搜索工具(BLAST)分析將分離株的部分β-微管蛋白(β-tub)和幾丁質(zhì)合酶(CHS)序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（AM116954,AM116950,AM116956,AM116946,AM114898,AM117414,AM114889,和AM117417）中的分離株進(jìn)行比較，以99-100%的相似性將這些分離株鑒定為巴西孢子絲菌。此外，將從所有分離株獲得的部分β-tub和CHS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中可用的孢子絲菌復(fù)合體參考菌株進(jìn)行比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示與巴西孢子絲菌相似，并且兩個(gè)基因都顯示出高bootstrap支持值（圖3A和B）。分離株5的部分CHS序列與前4株分離株相比有一個(gè)2-bp的多態(tài)性（位置109 A/C和151 G/C），表明該分離株在系統(tǒng)發(fā)育分析中存在變異性。獲得的β-tub和CHS編碼基因序列已存入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為KM222420至KM222429。
體外實(shí)驗(yàn)
為了表征其毒力，進(jìn)行了使用J774巨噬細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)，包括吞噬作用、真菌殺滅和巨噬細(xì)胞活力測(cè)定。有趣的是，分離株之間沒有發(fā)現(xiàn)差異（p>0.05），并且使用巴西孢子絲菌模式菌株獲得了類似的結(jié)果。酵母與巨噬細(xì)胞相互作用2小時(shí)后的吞噬指數(shù)范圍從分離株5的89%到分離株4的95%，并且巨噬細(xì)胞無(wú)法抑制巴西孢子絲菌的生長(zhǎng)，18小時(shí)后真菌存活率在96%至123%之間變化。在此時(shí)間點(diǎn)后，所有條件下的巨噬細(xì)胞活力約為90%（范圍從分離株5的89%到分離株3的92%）。
大蠟螟感染模型
通過(guò)用107個(gè)酵母細(xì)胞攻擊幼蟲，進(jìn)行了大蠟螟幼蟲的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比，接種酵母的幼蟲色素沉著增強(qiáng)（圖4A）。獲得了3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的生存曲線。與對(duì)照組相比，所有分離株都降低了幼蟲的存活率（P<0.0001），但與注射分離株5的幼蟲組相比，這種降低始終顯著更高。圖4B顯示了3個(gè)實(shí)驗(yàn)合并數(shù)據(jù)的生存曲線，其中分離株5的中位生存期為7天，而其他分離株為9-11天（P<0.0001）。未感染對(duì)照組的中位生存期為14天。我們還用104和106個(gè)酵母進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，但在這些接種量下，幼蟲的存活率與未感染對(duì)照組相似（數(shù)據(jù)未顯示）。
在大蠟螟感染后第3天和第6天，真菌負(fù)荷沒有顯著差異。感染后第6天獲得的CFU范圍從分離株4的1.4 x 107到分離株1的8.2 x 107。
推定毒力因子
由于我們發(fā)現(xiàn)分離株5在大蠟螟中的毒力與其他分離株不同，我們?cè)u(píng)估了與毒力相關(guān)的因素是否可以解釋這種變化的原因。在37°C下使用Christensen尿素肉湯測(cè)定脲酶產(chǎn)量，所有5株分離株在4天和7天后均為陽(yáng)性，559 nm處的平均吸光度沒有差異。通過(guò)測(cè)量瓊脂上azoalbumin降解暈圈確定的蛋白酶活性范圍從0.6到0.76，分離株1的活性最高（p/z=0.6）。該活性與分離株2（p=0.016）和分離株4（p=0.0005）有顯著差異。分離株產(chǎn)生的DHN-黑色素比例（通過(guò)干重DHN-黑色素/干重酵母比率獲得）沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有分離株在35和37°C下生長(zhǎng)，在39°C下均不生長(zhǎng)。此外，分離株在BHI培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線相似，它們之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05；圖5）。對(duì)于氧源性物質(zhì)的暴露，分離株2在暴露4小時(shí)時(shí)生長(zhǎng)抑制最高，這與分離株3和分離株4有顯著差異（P<0.05）（圖6A）。
其他時(shí)間間隔的差異不顯著。暴露于活性氮中間體降低了分離株的存活率，但分離株5的存活率在檢查時(shí)間內(nèi)始終高于其他分離株。然而，這些差異不顯著（圖6B）。
藥敏試驗(yàn)
對(duì)所有分離株的抗真菌藥物敏感性相似，特比萘芬的MIC為0.06μg/mL，伊曲康唑?yàn)?.0μg/mL，酮康唑和兩性霉素為2.0μg/mL，伏立康唑≥8.0μg/mL。
討論
我們的研究重點(diǎn)是對(duì)該患者連續(xù)分離株的表征，考慮到他在11年期間孢子絲菌病的臨床侵襲性和治療困難，疾病播散到皮膚和骨骼。我們必須指出，缺乏先前治療在巴西某些人群中非常普遍，原因是農(nóng)村地區(qū)距離診所遙遠(yuǎn)、即使像碘化鉀這樣便宜的藥物也負(fù)擔(dān)不起，以及不愿接觸醫(yī)療系統(tǒng)。盡管患有糖尿病和高血壓，該患者之前是健康的，這體現(xiàn)在他作為磚瓦工在physically stressful條件下積極工作的能力，并且為尋找可能的潛在免疫抑制狀況進(jìn)行的測(cè)試沒有顯示異常。初始T細(xì)胞的減少可能與慢性感染引起的淋巴細(xì)胞持續(xù)刺激，誘導(dǎo)其分化有關(guān)。
考慮到該患者疾病的慢性和復(fù)發(fā)性，我們考慮了可能性：1)他可能被不同物種或菌株再感染，或者2)隨著時(shí)間的推移，感染菌株的毒力發(fā)生了變化。然而，我們確認(rèn)每個(gè)分離株都是巴西孢子絲菌。雖然不確定，但發(fā)現(xiàn)分離株在指紋PCR中的條帶模式?jīng)]有差異（圖2）表明它們是相同的；然而，這并不能排除隨著時(shí)間的推移被同一菌株再感染，而不是慢性疾病的復(fù)發(fā)。
分離株5的CHS編碼基因的多態(tài)性表明幾丁質(zhì)合酶基因發(fā)生了改變，這可能通過(guò)影響幾丁質(zhì)合成和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來(lái)增加毒力。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁和隔膜的重要組成部分，存在于所有已知的致病性真菌中，但不存在于人類中。毒力決定因素包括宿主識(shí)別和入侵所需因子以及保護(hù)免受宿主防御系統(tǒng)侵害的因子。由于細(xì)胞壁參與這些過(guò)程，它保護(hù)真菌細(xì)胞免受外部損傷，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對(duì)細(xì)胞壁成分的粘附，因此介導(dǎo)免疫反應(yīng)。因此，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其組成的任何變化都可能影響真菌毒力。迄今為止，幾丁質(zhì)已與其他真菌的毒力相關(guān)，如巴西副球孢子菌，莢膜組織胞漿菌和皮炎芽生菌。幾丁質(zhì)沉積可能影響黑化作用，這是另一種與細(xì)胞壁和致病性真菌（包括孢子絲菌）毒力相關(guān)的重要因素。因此，幾丁質(zhì)的改變可能導(dǎo)致毒力的改變。
我們的體外巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)沒有顯示患者分離株之間的毒力差異：巨噬細(xì)胞有效地吞噬了酵母，但一旦攝入后無(wú)法殺死它們。然而，我們使用大蠟螟幼蟲的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致接種分離株5的幼蟲死亡率consistently higher，該分離株是在INI隨訪5年后（疾病總共11年后）獲得的，這強(qiáng)烈表明該分離株的毒力發(fā)生了變化。應(yīng)該指出，大蠟螟模型已成功用于其他真菌和細(xì)菌，38-40本研究代表了其在巴西孢子絲菌中的首次使用。大蠟螟模型相對(duì)于嚙齒動(dòng)物系統(tǒng)具有優(yōu)勢(shì)，例如成本低、易于儲(chǔ)存和處理以及更有利的倫理方面。
測(cè)定脲酶和DHN-黑色素以及我們?cè)u(píng)估耐熱性的實(shí)驗(yàn)顯示分離株之間沒有差異。蛋白酶活性不均勻，但分離株1測(cè)得的較高活性與所有其他分離株相比并不一致，并且似乎并未意味著該分離株毒力增加，如毒力實(shí)驗(yàn)所證明。所有分離株的抗真菌藥物敏感性相似。將我們患者菌株中發(fā)現(xiàn)的MIC與先前發(fā)表的里約熱內(nèi)盧孢子絲菌屬41和巴西孢子絲菌42的藥敏譜進(jìn)行比較，特比萘芬對(duì)分離株產(chǎn)生了最好的體外療效，而唑類藥物和兩性霉素B分別具有較差和中等的MIC結(jié)果。值得注意的是
7個(gè)各分離株酵母或巴西孢子絲菌參考CBS菌株（置于10μL無(wú)菌PBS中）的幼蟲。幼蟲在37°C下維持。N=每組60只幼蟲。
盡管特比萘芬的MIC較低，但這是該患者多年來(lái)治療僅取得中等成功的藥物。
最后，評(píng)估對(duì)氧化應(yīng)激敏感性的測(cè)試顯示，分離株對(duì)活性氮中間體的敏感性高于對(duì)氧源性物質(zhì)的敏感性。值得注意的是，分離株5對(duì)活性氮中間體的抵抗力最強(qiáng)。抵抗類似于巨噬細(xì)胞溶酶體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的不良條件的能力可以解釋該分離株毒力更高的原因；然而，我們的結(jié)果不能完全得出結(jié)論。盡管如此，這一發(fā)現(xiàn)可能部分促進(jìn)了該分離株的更高毒力。i
由于患者自發(fā)病以來(lái)已退休，遠(yuǎn)離了他可能感染的環(huán)境，我們的數(shù)據(jù)表明，合理地得出結(jié)論他一直是慢性感染。此外，將該患者的分離株鑒定為巴西孢子絲菌有些令人驚訝，因?yàn)槲覀儧]有發(fā)現(xiàn)與接觸貓的任何流行病學(xué)聯(lián)系，并且患者居住在里約熱內(nèi)盧孢子絲菌病“帶”以外的市鎮(zhèn)。
我們的數(shù)據(jù)支持結(jié)論，即該患者在11年期間感染了相同的真菌。盡管其體外對(duì)特比萘芬敏感，但巴西孢子絲菌菌株通過(guò)逃避他的免疫系統(tǒng)反應(yīng)有效地留在了患者體內(nèi)。此外，大蠟螟研究表明，在該患者的疾病過(guò)程中毒力發(fā)生了演變。我們懷疑寄生蟲-宿主關(guān)系中存在其他未研究的方面，導(dǎo)致了這種毒力的增加，需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明這些因素。我們認(rèn)為這項(xiàng)體內(nèi)和體外研究是獨(dú)特的，因?yàn)樗C明了巴西孢子絲菌在患有慢性和播散性孢子絲菌病的宿主體內(nèi)毒力的演變。
致謝
感謝David Alejandro Sanchez在毒力實(shí)驗(yàn)中的幫助，感謝Otávio Espíndola博士進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，感謝Nelson Lima博士提供墨西哥孢子絲菌菌株。
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