導(dǎo)讀
本研究旨在尋找能夠在不利環(huán)境中促進(jìn)小球藻(Chlorella)生長(zhǎng)的微藻促生菌(microalgae-promoting bacteria,MGPB)。從4種小球藻中分離出50株共生細(xì)菌，并通過(guò)16S rRNA基因序列進(jìn)行鑒定。功能篩選和二元培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將這些菌株中的43株列為MGPB。在不利環(huán)境條件下(缺鐵、高鹽度或不適宜的海水環(huán)境)觀察到，MGPB處理的微藻的生長(zhǎng)參數(shù)顯著高于未接種對(duì)照，并且Dinoroseobacter shibae是最有效的菌株。以取自不同海域海水(S-海水和Q-海水)（均去除微藻并添加營(yíng)養(yǎng)鹽）為培養(yǎng)基，無(wú)菌小球藻在Q-海水中生長(zhǎng)旺盛，但不能在交替單胞菌屬(Alteromonas)和弧菌屬(Vibrio)相對(duì)豐富的S-海水中生長(zhǎng)。然而，當(dāng)向S-海水中加入250μL/L的D.shibae時(shí)(OD600=0.1)，小球藻則能旺盛生長(zhǎng)。小球藻在接種D.shibae后的S-海水和Q-海水中的生長(zhǎng)速率沒(méi)有顯著差異(P>；0.05)，但均顯著低于(P<；0.05)Q-海水。16S rRNA基因分析顯示，在添加了D.shibae的Q-海水和S-海水中生長(zhǎng)的微藻出現(xiàn)了相似的藻際細(xì)菌群落，表現(xiàn)為招募了更多的紅桿菌科(Rhodobacteriaceae)微生物（例如Ruegeria sp.），更少的假單胞菌科(Pseudomonadaceae)微生物（例如Pseudomonas sp.）。這些結(jié)果表明，添加共生MGPB可以改變?cè)咫H細(xì)菌群落。在脅迫條件下接種MGPB對(duì)小球藻的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但在適宜的環(huán)境下可能無(wú)效。這些結(jié)果也表明，分離出的MGPBs，特別是D.shibae，可以開(kāi)發(fā)為一種生物接種劑，用于在不利環(huán)境中初步建立小球藻群落。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
結(jié)果與討論
1、微藻和細(xì)菌分離
將單藻種培養(yǎng)的小球藻Chlorella sp.HN11在液體和瓊脂抗生素培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)至少5代，獲得無(wú)菌小球藻株(AHN11)。從4株小球藻中分離出50個(gè)可培養(yǎng)的共生細(xì)菌菌落，隸屬于4門(mén)33屬(包括7個(gè)未知種)(圖1)。分離到的細(xì)菌80%屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)，共有27屬40種；12%屬于厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，有4屬6種；6%屬于放線(xiàn)菌門(mén)(Actinomycetes)，有1屬3種；2%隸屬于擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)，有1屬1種。
細(xì)菌功能結(jié)果顯示(表1)，有9株溶磷菌、2株溶鉀菌、12株產(chǎn)鐵載體細(xì)菌、33株固氮細(xì)菌、14株產(chǎn)ACC脫氨酶細(xì)菌和4株產(chǎn)IAA細(xì)菌。部分菌株具有多種功能，證明了有益細(xì)菌在微藻培養(yǎng)中的重要性。
圖1.Sankey圖顯示了本研究中分離的50種海洋細(xì)菌基于其16S rDNA序列的關(guān)系。
表1.分離的細(xì)菌及其篩選出的功能。
2、共生細(xì)菌和無(wú)菌小球藻的二元培
2.1、正常培養(yǎng)條件下
微藻表現(xiàn)出的生物現(xiàn)象與其伴生細(xì)菌密不可分。二元培養(yǎng)144 h后，結(jié)果表明，分離出的共生細(xì)菌中有86%(50株中有43株)對(duì)小球藻有積極的促生作用(圖2)，可歸類(lèi)為微藻促生菌（MGPB）。其中，D.shibae對(duì)小球藻的促生作用最好，而H.meridiana、M.aquimarina、P.flexa、M.populi、Mesorhizobium sp.、B.bullata和M.salsuginis對(duì)小球藻的生長(zhǎng)無(wú)促進(jìn)作用。所有分離出的共生細(xì)菌均顯著提高了(P<；0.1)小球藻的最大熒光量子產(chǎn)率(Fv/Fm)(圖2B)，這意味著盡管共生細(xì)菌中有部分未表現(xiàn)出促生作用，但對(duì)小球藻光合是有益的。
圖2.AHN11與共生細(xì)菌的二元培養(yǎng)。(A)通過(guò)細(xì)胞密度變化計(jì)算的相對(duì)生長(zhǎng)率。(B)96小時(shí)微藻Fv/Fm。橫坐標(biāo)表示添加菌株；CK是無(wú)菌微藻培養(yǎng)物。處理組和對(duì)照組在第192小時(shí)的生長(zhǎng)速率差異：無(wú)差異(ns)，P<；0.05(*)，P<；0.01(**)。
2.2、在缺鐵條件下
鐵是光合作用和呼吸作用的重要元素。本研究分離的12株產(chǎn)鐵載體細(xì)菌分別與AHN11在缺鐵培養(yǎng)基中共培養(yǎng)(圖3)，同時(shí)，以一株不產(chǎn)生鐵載體的MGPB菌株R.porphyridii作為對(duì)照。由于鐵的限制，AHN11的生長(zhǎng)速率和Fv/Fm均受到抑制。當(dāng)AHN11與MGPB共培養(yǎng)時(shí)，12株產(chǎn)鐵載體細(xì)菌中有6株能夠促進(jìn)微藻在缺鐵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)(P<；0.5)，且添加D.shibea能使微藻獲得最高的生長(zhǎng)速率和Fv/Fm。盡管B.vestrisii、H.meridiana、B.altitudinis、A.tumefaciens、D.tsuruhatensis和B.massiliensis都具有鐵載體活性，但它們?cè)谌辫F條件下對(duì)微藻生長(zhǎng)沒(méi)有影響。不產(chǎn)生鐵載體的MGPB菌株R.porphyridii在這種缺鐵條件下對(duì)微藻生長(zhǎng)也沒(méi)有促進(jìn)作用。因此，并非所有產(chǎn)鐵載體的細(xì)菌都能在缺鐵時(shí)促進(jìn)微藻生長(zhǎng)，這可能與細(xì)菌釋放鐵載體的類(lèi)型或含量不同有關(guān)。
圖3.AHN11與假定產(chǎn)鐵載體細(xì)菌在缺鐵培養(yǎng)基中的二元培養(yǎng)物。(A)通過(guò)細(xì)胞密度變化計(jì)算的相對(duì)生長(zhǎng)率。(B)第96小時(shí)測(cè)定的微藻Fv/Fm。與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組進(jìn)行比較的差異：無(wú)差異(ns)，P<；0.5(*)，P<；0.1(**)，P<；0.01(**)。
2.3、在高鹽條件下
從分離的細(xì)菌中隨機(jī)選取6株MGPBs，與無(wú)菌小球藻AHN11在高鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行二元培養(yǎng)。隨著鹽度的增加，純培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率降低，而與細(xì)菌共培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速率提高(圖4)。除P.stutzeri外，與鹽度為30時(shí)相比，MGPB對(duì)微藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用在鹽度為45時(shí)增強(qiáng)，在鹽度為60時(shí)減弱。當(dāng)微藻與P.stutzeri共培養(yǎng)時(shí)，與鹽度為30時(shí)相比，鹽度為45時(shí)生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)減弱，鹽度為60時(shí)生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)增強(qiáng)，這表明在較高鹽度下，P.stutzeri提高微藻耐鹽性的能力最強(qiáng)。P.stutzeri是一種常見(jiàn)的植物促生細(xì)菌(PGPB)，廣泛應(yīng)用于改善植物在遞增鹽度梯度下的生長(zhǎng)。而在微藻中，影響其鹽度適應(yīng)的驅(qū)動(dòng)因素是微藻-細(xì)菌相互作用，即特定微生物的存在改變了微藻的鹽適應(yīng)性，這可能歸因于細(xì)菌分泌的耐鹽酶。在所有鹽度下，所有二元培養(yǎng)液的Fv/Fm均極顯著高于AHN11單培養(yǎng)液(P<；0.1)(圖4B)，進(jìn)一步證明了MGPB能夠緩解小球藻的鹽脅迫。
在上述所有條件下，D.shibea對(duì)微藻的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最好。D.shibea是玫瑰桿菌分支的一員，最初從鞭毛藻中分離出來(lái)，并已被證明是一種普遍存在的海洋微藻共生體。研究發(fā)現(xiàn)，D.shibea可以分泌多種外生代謝物，包括B族維生素前體和生長(zhǎng)因子，這可能有利于微藻的生長(zhǎng)。此外，代謝組學(xué)分析顯示，當(dāng)與D.shibea共培養(yǎng)時(shí)，假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)細(xì)胞中的多種氨基酸、脂肪酸和C4糖的表達(dá)均有上調(diào)。本研究已經(jīng)證實(shí)D.shibea具有鐵載體、ACC脫氨酶活性和固氮作用，有助于微藻利用不溶性鐵、N2和降解ACC(乙烯的前體)，從而促進(jìn)微藻生長(zhǎng)。56631669418228138
圖4.不同鹽度下的AHN11。(A)通過(guò)細(xì)胞密度變化計(jì)算的相對(duì)生長(zhǎng)率。(B)第96小時(shí)微藻Fv/Fm。與對(duì)照組相比的差異：P<；0.5(*)，P<；0.1(**)，P<；0.01(**)。
3、MPGB與無(wú)菌小球藻在天然海水中的共培養(yǎng)
3.1、MPGB對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響
使用兩種天然海水(S和Q)配制寧波3號(hào)培養(yǎng)基。培養(yǎng)96 h后，微藻細(xì)胞密度差異顯著（圖5）。AHN11在S-海水(S)、無(wú)菌S-海水(S-)、添加混合細(xì)菌的S-海水(S+M)或無(wú)菌Q-海水(Q-)中幾乎不生長(zhǎng)。環(huán)境中的細(xì)菌可能是影響微藻生長(zhǎng)的主要因素，因?yàn)闊o(wú)機(jī)養(yǎng)分在這些培養(yǎng)基中是充足的，非生物環(huán)境因素（如pH和鹽度）也是有利的。只有當(dāng)D.shibae被添加到S-海水(S+D)中時(shí)，無(wú)菌小球藻才能像在添加了D.shibae的Q-海水(Q+D)中一樣生長(zhǎng)旺盛。小球藻在未滅菌的Q-海水(Q)中生長(zhǎng)最好。然而，當(dāng)添加D.shibae(Q+D)或混合細(xì)菌(Q+M)時(shí)，微藻細(xì)胞密度與未滅菌的Q-海水(Q)相比有所下降，但其Fv/Fm無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>；0.5)(圖5)。結(jié)果表明，在微生物組成對(duì)微藻不利的環(huán)境中，添加有益細(xì)菌可以促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，但在有利的環(huán)境下可能無(wú)效。
圖5.AHN11在S或Q海水培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。(A)微藻的生長(zhǎng)。(B)微藻的Fv/Fm。S-&Q-：高壓滅菌寧波3號(hào)S-或Q-海水。S&Q：寧波3號(hào)S-或Q-海水。S+D&Q+D：接種ANH11和D.shibae的寧波3號(hào)S-或Q-海水。S+M&Q+M：接種ANH11和混合細(xì)菌的寧波3號(hào)S-或Q-海水。與對(duì)照組相比，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)標(biāo)記差異：P<；0.5(*)，P<；0.1(**)，P<；0.01(**)。
3.2、添加MPGB對(duì)小球藻藻際微生物的影響
為了證實(shí)上述假設(shè)，通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)一步分析了處理之間的細(xì)菌群落組成。五個(gè)樣品共獲得1,071,093個(gè)16S rRNA基因序列，去除低質(zhì)量序列后，每個(gè)樣品平均獲得63,202個(gè)reads，并用于后續(xù)分析。共獲得細(xì)菌操作分類(lèi)單元（OTUs）3639個(gè)，注釋為518個(gè)屬，注釋率為85.47%。
3.3、海水和藻際微生物組的多樣性
Chao1和Shannon指數(shù)分別表示樣品中OTU的數(shù)量和群落多樣性。如圖6A所示，Q-海水(QA)或添加了D.shibae的Q-海水(QAD)中藻際細(xì)菌的多樣性均顯著高于Q-海水中原生細(xì)菌的多樣性(Q)。在添加了D.shibae的S-海水(SAD)中，藻際微生物的多樣性顯著低于Q-海水中原生細(xì)菌的多樣性(Q)，但與S-海水中原生細(xì)菌的多樣性(S)差異不顯著。而在S-海水中，由于生物量低，無(wú)法檢測(cè)到藻際微生物。這表明小球藻在Q-海水中可以招募更多的藻際微生物，而在添加有D.shibae的S-海水中可能只招募有利于其生長(zhǎng)的微生物。PCoA反映了樣本間的群落組成關(guān)系，距離越近，樣本間的群落組成越相似(圖6B)。在三種環(huán)境(QA、QAD和SAD)中，藻際微生物組成是聚集的。這表明，雖然SAD中的藻際微生物多樣性較低，但物種組成與QA和QAD相似，盡管LEfSe(線(xiàn)性判別分析效應(yīng)大小)和Venn圖顯示了它們之間的差異(圖6C)。
LEfSe(圖6C左)揭示了在豐度上存在顯著差異的物種，Venn圖(圖6C右)總結(jié)了共有或特有物種之間的聯(lián)系。在QAD和QA中發(fā)現(xiàn)了較為豐富的優(yōu)勢(shì)種(如QA中的Bacteroides和Roseivvirga，以及QAD中的Parasegetibacter和Lewinella)，這表明微藻促生菌D.shibae的添加在改變?cè)咫H微生物的原始平衡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
圖6.細(xì)菌組成差異。(A)α-多樣性。(B)β-多樣性。(C)海洋樣本中的共有物種和特有物種。S&Q：S-或Q-海水中的細(xì)菌組成。QA：寧波3號(hào)Q-海水中培養(yǎng)的藻際細(xì)菌組成。SAD&QAD：在添加有D.shibae的寧波3號(hào)S-或Q-海水中培養(yǎng)的藻際細(xì)菌組成。
3.4、海水和藻際微生物組的組成
變形菌門(mén)（Proteobacteria）是所有五個(gè)樣本中的優(yōu)勢(shì)門(mén)，占OTU序列總數(shù)的87.17%±3.41%。與海水原生菌群相比，藻際積累了更多的α-變形菌(Alpha-Proteobacteria)，而γ-變形菌(Gamma-Proteobacteria)的相對(duì)豐度降低(圖7A)。在更高的分類(lèi)學(xué)水平上(科或?qū)偎?，組成細(xì)菌分類(lèi)群的相對(duì)貢獻(xiàn)因樣品而異(圖7B，C)。然而，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分類(lèi)群的組成也有明顯的相似性。魯杰氏菌屬(Ruegeria)在兩種海水中的相對(duì)豐度較低，但在藻際中富集。相比之下，在海水中相對(duì)豐度較高的交替單胞菌屬(Alteromonas)、弧菌屬(Vibrio)和Corallomonas是藻際中的稀有類(lèi)群。這表明微藻能夠選擇性地招募特定菌群，并抑制弧菌科(Vibrionaceae)等病原菌的生長(zhǎng)。正如Mars Brisbin等人的研究顯示，細(xì)菌和微藻之間存在特定的有益相互作用，這些相互作用由確定性的群落組裝穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)組裝而成。Nitrincolaceae和紅桿菌科(Rhodobacteraceae)是Q海水中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，相對(duì)豐度分別為35.98%和18.69%。其中隸屬于Nitrincolaceae的Corallomonas sp.相對(duì)豐度最高，為30.74%。在QA中，Rhodobacteraceae和假單胞菌科(Pseudomonadaceae)在藻際中的相對(duì)豐度顯著增加。假單胞菌屬(Pseudomonas)的相對(duì)豐度達(dá)到25.91%，而屬于Rhodobacteraceae的Ruegeria相對(duì)豐度達(dá)到13.08%。據(jù)報(bào)道，紅桿菌對(duì)浮游植物有益，其相對(duì)豐度與葉綠素A濃度呈正相關(guān)，這可以解釋其在藻際中的富集現(xiàn)象。假單胞菌是常見(jiàn)的植物促生長(zhǎng)細(xì)菌(PGPB)，對(duì)微藻的生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用。S-海水中的原生菌群由以Alteromonas和Vibrio為代表的交替單胞菌科(Alteromonadaceae)和弧菌科(Vibrionaceae)構(gòu)成。Alteromonas是一種常見(jiàn)的微藻致死細(xì)菌，可分泌微藻細(xì)胞裂解液(β-葡萄糖苷酶)，并通過(guò)碳輸入實(shí)現(xiàn)快速生長(zhǎng)。Vibrio可以利用微藻分泌的內(nèi)源性色氨酸合成并分泌熒光素，進(jìn)而合成IAA，破壞微藻細(xì)胞膜，加速微藻細(xì)胞裂解。這可能是小球藻在這種海水培養(yǎng)基中難以生長(zhǎng)的原因。
圖7.細(xì)菌組成。(A)綱水平上樣本OTU的分布。(B)科水平上樣本OTU的分布。(C)屬水平上樣本OTU的分布。(D)屬水平上樣本細(xì)菌群落組成。S&Q：S-或Q-海水中的細(xì)菌組成。QA：寧波3號(hào)Q-海水中培養(yǎng)的藻際細(xì)菌組成。SAD&QAD：在添加有D.shibae的寧波3號(hào)S-或Q-海水中培養(yǎng)的藻際細(xì)菌組成。
3.5、細(xì)菌分類(lèi)群與D.shibae添加之間的關(guān)聯(lián)
在寧波Q-海水培養(yǎng)物中接入少量的D.shibae后，微藻生長(zhǎng)下降(圖5)。在QAD中，Rhodobacteraceae的相對(duì)豐度增加，Ruegeria的相對(duì)豐度達(dá)到21.41%，而Pseudomonadaceae的相對(duì)豐度下降。這可能歸因于群體感應(yīng)(QS)和群體淬滅機(jī)制，它們破壞了藻際微生物的平衡，影響了微藻的生長(zhǎng)。D.shibae和Ruegeria是玫瑰桿菌分支的成員，釋放與玫瑰桿菌鞭毛形成和運(yùn)動(dòng)相關(guān)的?；呓z氨酸內(nèi)酯QS。它可以防止玫瑰桿菌在擁擠和潛在有限的微環(huán)境中聚集，并促進(jìn)其在宿主中更均勻的定殖。我們推測(cè)，D.shibae的加入將導(dǎo)致培養(yǎng)物中QS的含量增加，并促進(jìn)更多Ruegeria和D.shibae定殖(圖7C)。玫瑰桿菌分支成員也被發(fā)現(xiàn)通過(guò)產(chǎn)生抑制性化合物和采用擴(kuò)散性殺傷機(jī)制來(lái)抑制或殺死其競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手，這也可能是由QS誘導(dǎo)的。研究發(fā)現(xiàn)Ruegeria可殺死Vibrio，并對(duì)Pseudomonas有一定的抑制作用。這可能是藻際中Pseudomonas減少的原因。此外，細(xì)菌的引入還引起了其他變化，例如在QA中發(fā)現(xiàn)了Kiloniellaceae，但在QAD中沒(méi)有。熱圖聚類(lèi)分析(圖7D)顯示，QAD的微生物組成與SAD更相似(QAD和SAD首先聚在一起，然后與QA聚在一起)。Rhodobacteraceae在藻際中顯著富集，相對(duì)豐度從S-海水中的11.04%增加到55.61%(其中Ruegeria占34.4%)，而Pseudomonadaceae的相對(duì)豐度略低，從S-海水中的2.47%增加到9.75%(其中Pseudomonas占9.03%)。相比之下，海水富集的有害細(xì)菌Alteromonadaceae和Vibrionaceae的相對(duì)豐度從S-海水藻際中的50.17%下降到1.2%(其中Alteromonas占1.18%)和1.41%(其中Vibrio占1.41%)?？赡苡捎贒.shibae釋放的QS，有益細(xì)菌在藻際的定殖增加，同時(shí)環(huán)境中的有害細(xì)菌受到抑制，這使得小球藻能夠在S-海水環(huán)境中生長(zhǎng)。Ly等人的實(shí)驗(yàn)觀察到了類(lèi)似的結(jié)果，其中有益細(xì)菌減輕了環(huán)境強(qiáng)光對(duì)微藻的脅迫。本研究表明，添加MGPBs可以通過(guò)改變?cè)咫H微生物組促進(jìn)小球藻在不利環(huán)境中的生長(zhǎng)。目前對(duì)MGPBs的研究主要集中在微藻生物量和代謝物生產(chǎn)，以及收獲和凈化方面，而MGPB對(duì)藻際微生物組成的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。以往關(guān)于藻際微生物組的研究主要集中在有害細(xì)菌上。例如，添加具有殺藻活性的有害細(xì)菌會(huì)降低藻際微生物的多樣性，使更多添加的有害細(xì)菌和更少的Rhodobacteraceae在藻際中定殖，導(dǎo)致微藻大量裂解死亡。這些結(jié)果表明，引入D.shibae可以改變?cè)咫H微生物的組成。
結(jié)論
利用細(xì)菌來(lái)促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)和代謝是一種很有前景的生物技術(shù)應(yīng)用方法。本實(shí)驗(yàn)從4種小球藻中分離出50株共生細(xì)菌，其中86%為微藻促生菌(MGPB)。MGPB對(duì)微藻的生長(zhǎng)有一定影響，可以提高微藻的抗逆性。此外，還獲得了一株高效MGPB菌株D.shibae。接種D.shibae可以改變小球藻藻際微生物組的組成，使其招募更多的Rhodobacteraceae和更少的Pseudomonadaceae。這一方法能在不利微生物環(huán)境中促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)，但在有利環(huán)境中則會(huì)降低小球藻的生長(zhǎng)。本研究為MGPB在不利環(huán)境中促進(jìn)建立微藻群落補(bǔ)充了新的應(yīng)用。
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