吲哚在DOT-T1E中引發(fā)廣泛的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)
由于上述結(jié)果支持吲哚作為種內(nèi)和種間通訊的潛在次級信號分子，我們進一步檢測了惡臭假單胞菌DOT-T1E和T1E-18對吲哚的全局轉(zhuǎn)錄響應(yīng)：實驗在LB培養(yǎng)基中指數(shù)期生長的細胞中進行，將培養(yǎng)物分為兩組，其中一組添加300μM吲哚（選擇該濃度是因為其與大腸桿菌產(chǎn)生的吲哚濃度相當，且對惡臭假單胞菌的生長速率無不利影響）。
結(jié)果顯示，DOT-T1E在響應(yīng)吲哚時誘導(dǎo)43個基因表達，抑制23個基因表達（表4）；正如體外實驗結(jié)果所預(yù)期，ttgV和ttgGHI操縱子在吲哚存在時被誘導(dǎo)表達，而ttgABC操縱子未受影響；細胞還誘導(dǎo)了多個能量產(chǎn)生相關(guān)基因（如葡萄糖代謝的Entner-Doudoroff途徑基因T1E_1987、T1E_1988、T1E_2001和丙酮酸脫氫酶組分基因T1E_2648），這可能與三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）的底物供給增加及維持其正常運行相關(guān)；多個鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)也被誘導(dǎo)表達（T1E_1068、T1E_2509、T1E_5142），這一響應(yīng)可能與Nuo呼吸鏈細胞色素的合成需求相關(guān)；一些與氧化應(yīng)激相關(guān)的酶（如烷基氫過氧化物脫氫酶，T1E_5239）也被誘導(dǎo)表達，表明吲哚可引發(fā)輕微的氧化應(yīng)激響應(yīng)；與這種輕微應(yīng)激一致的是，僅有一個分子伴侶DnaK（T1E_0654）在吲哚響應(yīng)中上調(diào)超過3倍；多個靶標未知的調(diào)節(jié)蛋白也被誘導(dǎo)表達（表4），上述部分基因的誘導(dǎo)可能受這些調(diào)節(jié)蛋白的直接或間接調(diào)控；此外，參與谷氨酰胺/谷氨酸循環(huán)的多個基因以及氨基酸代謝相關(guān)酶也被誘導(dǎo)表達。為進一步驗證這些結(jié)果，我們對6-磷酸葡萄糖酸脫水酶（T1E_1987，edd）、醛脫氫酶（T1E_4523）、dnaK基因（T1E_0654）、外膜鐵載體受體（T1E_5142）、假設(shè)蛋白（T1E_0256）和TtgV編碼基因進行了qRT-PCR分析，結(jié)果顯示這些基因在吲哚存在時的表達水平比無吲哚時上調(diào)3.8-6.3倍。
我們在T1E-18（ttgABC缺陷菌株）中進行了相同實驗：T1E-18菌株中的外排泵ttgGHI上調(diào)2.6-3.7倍（表5）；且T1E-18中一些在親本菌株中未被誘導(dǎo)的基因也發(fā)生了誘導(dǎo)表達，特別是參與支鏈氨基酸代謝的基因（T1E_3322至T1E_3325、T1E_5100和T1E_5101）以及其他與氨基酸代謝相關(guān)的基因。這些結(jié)果表明，TtgABC的缺陷和TtgGHI的誘導(dǎo)會影響惡臭假單胞菌對吲哚的響應(yīng)。
討論
惡臭假單胞菌中TtgABC/TtgGHI RND外排泵介導(dǎo)抗生素排出在惡臭假單胞菌中，對殺菌和抑菌抗生素的主要耐藥機制是通過TtgABC泵排出抗生素。我們的結(jié)果顯示，氯霉素、紅霉素和四環(huán)素等抑菌化合物可抑制細胞生長，但細胞存活率保持100%；而氨芐西林和諾氟沙星兩種殺菌化合物首先抑制細胞生長，隨后導(dǎo)致細胞死亡。
TtgABC在抑菌和殺菌化合物排出中的作用明確——與野生型菌株相比，T1E-18突變體對測試抗生素的敏感性顯著提高；另一個外排泵TtgGHI被證實是抗生素耐藥性中的次級外排泵，依據(jù)是ttgABC/ttgGHI雙突變體比親本菌株和單突變體對這些藥物的敏感性更高。
我們發(fā)現(xiàn)，在氨芐西林或氯霉素存在下，本實驗條件及其他研究均未觀察到氧化應(yīng)激基因的誘導(dǎo)，這些結(jié)果與近期反駁“殺菌化合物通過產(chǎn)生活性氧（ROS）發(fā)揮普遍殺傷機制”的報道一致。
然而，值得注意的是，最初提出“殺菌化合物普遍殺傷機制”的依據(jù)是“殺菌化合物存在時HPF自發(fā)熒光被抑制，而抑菌化合物不存在該現(xiàn)象”。我們檢測了不同抗生素作用下惡臭假單胞菌DOT-T1E的HPF熒光淬滅情況，發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌DOT-T1E菌株在某些殺菌抗生素作用下會出現(xiàn)HPF自發(fā)熒光抑制，而氯霉素和四環(huán)素等抑菌抗生素則無此效應(yīng)。HPF淬滅與殺菌化合物相關(guān)這一點明確——缺乏主要抗生素外排泵的T1E-18突變體在低于親本菌株的氨芐西林濃度下即發(fā)生HPF熒光淬滅，而同時缺乏TtgABC和TtgGHI活性的雙突變體在更低濃度下就會出現(xiàn)淬滅；同時，T1E-18在吲哚存在時對殺菌化合物的耐藥性增強，且這些化合物誘導(dǎo)的HPF淬滅被部分緩解，表明兩種表型之間存在明確關(guān)聯(lián)，但其分子機制尚不清楚。
吲哚是惡臭假單胞菌識別的信號分子
在腸桿菌中，吲哚作為種內(nèi)信號分子，可增強對殺菌抗生素（氨芐西林、諾氟沙星）和抑菌抗生素（氯霉素、四環(huán)素、紅霉素）的耐藥性；吲哚也是一種種間信號分子，可調(diào)控無法產(chǎn)生吲哚的真核生物和原核生物的表型。已有研究表明，產(chǎn)吲哚的共生大腸桿菌菌株可影響人上皮細胞的基因表達，增強細胞連接緊密性、提高細胞因子的有益效應(yīng)，并抑制腸出血性大腸桿菌菌株在胃腸道中的定植，因此吲哚甚至可被視為跨界信號分子。
信號分子的一個特征是能夠影響一系列基因的表達。事實上，對多種革蘭氏陰性菌的全局轉(zhuǎn)錄研究表明，參與細胞間通訊的信號分子（如N-?；呓z氨酸內(nèi)酯、環(huán)肽和喹諾酮類）可影響感知信號的微生物的表達模式。本研究報道，吲哚作為一種胞外信號分子，可改變野生型惡臭假單胞菌DOT-T1E中76個基因的表達模式（43個誘導(dǎo)表達，23個抑制表達，表4）。盡管高濃度吲哚會延緩惡臭假單胞菌的生長，但該微生物在含1.5 mM吲哚的培養(yǎng)基中仍可指數(shù)生長。吲哚不僅誘導(dǎo)抗生素外排泵，使抗生素敏感菌株獲得在含抗生素培養(yǎng)基中生長的競爭優(yōu)勢，還調(diào)控與8個COG功能組相關(guān)的一系列基因（氨基酸代謝、無機離子代謝、外排泵、能量產(chǎn)生與碳水化合物代謝、金屬轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)蛋白和假設(shè)蛋白）。本研究結(jié)果表明，TtgGHI泵是細菌細胞通訊相關(guān)通路的一部分——它可被其他微生物產(chǎn)生的信號分子誘導(dǎo)，通過該誘導(dǎo)作用，惡臭假單胞菌菌株能夠在不利條件下存活。在假單胞菌中，吲哚誘導(dǎo)精氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸等氨基酸的分解代謝，這與大腸桿菌中的觀察結(jié)果一致，也與“氨基酸分解代謝能力是穩(wěn)定期存活和競爭的重要因素”的研究結(jié)論相符，表明吲哚信號傳導(dǎo)可能在細胞適應(yīng)營養(yǎng)匱乏環(huán)境的通路中發(fā)揮作用（在這種環(huán)境中，氨基酸分解代謝對能量產(chǎn)生至關(guān)重要）。
總之，我們的結(jié)果支持以下結(jié)論：惡臭假單胞菌中的RND外排泵與抗生素耐藥性密切相關(guān)，這些泵可被底物誘導(dǎo)（如TtgABC）或信號分子誘導(dǎo)（如吲哚誘導(dǎo)TtgGHI）。底物誘導(dǎo)的泵可被視為微生物抗生素耐藥性的自主元件，而信號分子（尤其是種間信號）誘導(dǎo)的泵可被視為細菌群落觸發(fā)的耐藥程序的一部分。這在感染和抗生素治療中具有重要意義——抗生素已被廣泛用于治療感染，但隨之而來的是微生物耐藥性的增加，導(dǎo)致治療效果顯著下降；因此，鑒定誘導(dǎo)抗生素耐藥性的信號分子對于對抗抗生素耐藥性至關(guān)重要，對于多重微生物引起的感染而言無疑具有重要意義。
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