結(jié)果
hk11和rr11缺失突變體的遺傳確認(rèn)。
通過(guò)使用blastP算法將相鄰開(kāi)放閱讀框的推導(dǎo)氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，對(duì)hk/rr11區(qū)域周?chē)倪z傳位點(diǎn)進(jìn)行了注釋。該位點(diǎn)的圖譜和描述如圖1所示。hk11基因位于變形鏈球菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的bp 455345至456349處，編碼一個(gè)推定的334個(gè)氨基酸的假設(shè)蛋白，預(yù)測(cè)分子量為38,113 Da。hk11 ORF與來(lái)自化膿性鏈球菌的推定的雙組分傳感器組氨酸激酶（登錄號(hào)AAK34394）（blast相似性得分=352）；來(lái)自肺炎鏈球菌的推定的組氨酸激酶HK03（CAB54570）（blast得分=244）；以及來(lái)自耐鹽芽孢桿菌的推定的組氨酸激酶BH1199（BAB04918）（blast得分=177）具有最高相似性。
編碼rr11的ORF位于bp 456336至456983，編碼一個(gè)推定的215個(gè)氨基酸的假設(shè)蛋白，預(yù)測(cè)分子量為24,067 Da。有趣的是，這些基因重疊了12個(gè)核苷酸，并且應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白編碼基因在其推定起始密碼子5'端有一個(gè)啟動(dòng)子樣結(jié)構(gòu)。在這個(gè)5'近端區(qū)域，-18至-10序列TACCAACT與肺炎鏈球菌的com-box共識(shí)序列僅相差一個(gè)堿基對(duì)（TACGAACT）。這些com-box基因構(gòu)成了CSP介導(dǎo)的調(diào)節(jié)子的一部分。hk11基因也有推定的-10（-12,TAATGA）和-35（TGTTATGGA）啟動(dòng)子序列。然而，它在這個(gè)附近似乎沒(méi)有com-box。與hk11基因類似，rr11與來(lái)自化膿性鏈球菌的相應(yīng)應(yīng)答調(diào)節(jié)基因（SPy1621）和來(lái)自肺炎鏈球菌的R03基因具有最高同源性，但與來(lái)自枯草芽孢桿菌的假設(shè)應(yīng)答調(diào)節(jié)基因yvqC具有更高的相似性，而不是與耐鹽芽孢桿菌的同源物。目前尚未將任何推定的底物或信號(hào)分配給這些生物體中的任何這些系統(tǒng)。
PCR確認(rèn)證明，hk11和rr11突變體的靶基因在其各自的突變體中正確地被Erm盒替換（數(shù)據(jù)未顯示）。經(jīng)PCR確認(rèn)的突變體分別命名為SMHK11和SMRR11。生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)顯示，兩種突變體在SDM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率均下降（倍增時(shí)間增加）：SMHK11的Td=1.47小時(shí)，SMRR11的Td=1.43小時(shí)，而親本菌株的Td=1.27小時(shí)。然而，突變體在TYEG（圖2）或SDM培養(yǎng)基（數(shù)據(jù)未顯示）中生長(zhǎng)12小時(shí)后的最終生長(zhǎng)產(chǎn)量似乎與親本菌株相同。兩種突變體與親本菌株類似，能夠變得具有遺傳感受態(tài)，并且無(wú)論是否添加CSP，都能被質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化，這表明由hk/rr11編碼的系統(tǒng)不影響該生物的感受態(tài)發(fā)展。
刪除hk11或rr11導(dǎo)致生物膜形成缺陷。
刪除hk11或rr11基因?qū)е律锬ば纬扇毕?，如圖3所示。菌株SMHK11的生物膜密度約為親本菌株NG8的50%，菌株SMRR11的密度約為親本菌株的75%。觀察到的突變體生物膜密度降低不太可能是由于它們略微降低的生長(zhǎng)速率所致，特別是因?yàn)樗鼈冊(cè)谥行詐H下的生長(zhǎng)產(chǎn)量與親本菌株在TYEG（圖2）和SDM培養(yǎng)基（數(shù)據(jù)未顯示）中幾乎相同。
通過(guò)SEM更仔細(xì)地檢查生物膜發(fā)現(xiàn)，突變體形成的生物膜外觀與親本生物膜非常不同。突變體的生物膜似乎具有海綿狀結(jié)構(gòu)，其中似乎存在大的細(xì)胞間間隙（圖4）。我們發(fā)現(xiàn)，在生物膜測(cè)定制備過(guò)程中，由hk11和rr11突變體形成的這種生物膜比親本菌株形成的生物膜更容易從表面洗脫。此外，突變體的靜息細(xì)胞粘附到粘蛋白包被的聚苯乙烯表面的能力降低（粘附到表面的細(xì)胞百分比±[標(biāo)準(zhǔn)差]：NG8,12.08[2.04]；HK11,6.77[1.32]；RR11,8.36[1.53]）。綜上所述，海綿狀結(jié)構(gòu)的明顯缺陷以及細(xì)胞對(duì)表面粘附的較低親和力可能導(dǎo)致觀察到的突變體生物量減少。SEM還顯示，當(dāng)以生物膜形式生長(zhǎng)時(shí)，SMHK11和SMRR11都形成了非常長(zhǎng)的鏈，與野生型菌株相比。
圖4.掃描電子顯微照片顯示變形鏈球菌菌株形成的生物膜的空間分布和結(jié)構(gòu)。
由于懷疑這種表型與CSP激活的途徑有關(guān)，我們檢查了CSP對(duì)hk/rr11突變體細(xì)胞鏈形成的影響。向生物膜培養(yǎng)物中添加CSP并未顯著改變SMHK11和SMRR11突變體形成的鏈長(zhǎng)度。為了從SEM圖像定量鏈長(zhǎng)度，從隨機(jī)選擇的四個(gè)獨(dú)立鏈獲得平均值。每個(gè)鏈的平均細(xì)胞數(shù)（±SD）如下：NG8（野生型），17（8.04）；HK11，42（13.8）；RR11，38（11.3）。
hk11突變體存在酸耐受性缺陷。
與親本菌株NG8相比，SMHK11和SMRR11突變體在pH 5.5的液體培養(yǎng)物中均顯示出生長(zhǎng)速率降低。NG8的Td為100±1分鐘。SMHK11的Td為178±3分鐘，而SMRR11每207±9分鐘倍增一次（圖2）。突變體SMHK11在pH 5.0的瓊脂平板上的生長(zhǎng)也大大減弱，盡管它在pH 7.0的平板上（圖5）和pH 7.0的肉湯中（圖2）生長(zhǎng)與親本菌株一樣好。有趣的是，我們未能在pH 5.0平板上檢測(cè)到SMRR11突變體與親本菌株NG8生長(zhǎng)之間的差異。為了更仔細(xì)地確定刪除hk11或rr11基因是否影響可誘導(dǎo)的ATR，我們使用先前描述的方法測(cè)定了在液體培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的突變體的對(duì)數(shù)期ATR。結(jié)果顯示，SMHK11突變體相對(duì)于親本菌株NG8具有降低的ATR（圖6）。然而，刪除rr11僅導(dǎo)致可誘導(dǎo)ATR輕微下降，如菌株SMRR11所示。
SMHK11的酸刺激子。通過(guò)比較暴露于pH 7.5和5.5條件下30分鐘的總細(xì)胞標(biāo)記蛋白的二維凝膠電泳，分析了NG8和SMHK11的ATR背后蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。在這些實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測(cè)的594個(gè)蛋白質(zhì)中，所有那些在酸暴露30分鐘后表達(dá)差異>2.0或<0.5的蛋白質(zhì)被分別分類為屬于NG8和SMHK11的酸刺激子。NG8的酸刺激子包括19個(gè)蛋白質(zhì)，其中12個(gè)顯示表達(dá)增加，7個(gè)顯示表達(dá)減少（圖7A和B；表3）。有趣的是，在酸沖擊后顯示表達(dá)增加的12個(gè)NG8蛋白質(zhì)中，有四個(gè)蛋白質(zhì)在突變菌株中沒(méi)有被誘導(dǎo)（圖7C和D；表3）。這些結(jié)果證實(shí)，SMHK11在誘導(dǎo)酸應(yīng)激蛋白方面相對(duì)于親本菌株NG8存在缺陷，并證實(shí)hk11在可誘導(dǎo)的ATR中起著重要作用。
表3.NG8和SMHK11中誘導(dǎo)或抑制的蛋白質(zhì)
| 因酸應(yīng)激表達(dá)變化>3倍的蛋白質(zhì)（NG8） | 是否屬于SMHK11酸應(yīng)激共有 |
| 表達(dá)增加 | |
| 4a（丙酮酸脫氫酶） | 是 |
| 26（未知） | 是 |
| 85（半胱氨酸合酶） | 是 |
| 87（外切多磷酸酶） | 否 |
| 155（未知） | 是 |
| 324（未知） | 是 |
| 814（未知） | 是 |
| 858（未知） | 否 |
| 1008（組氨酸激酶候選物） | 否 |
| 2009（未知） | 是 |
| 2120（未知） | 否 |
| 2403（未知） | 是 |
| 表達(dá)減少b | |
| 94（未知） | 是 |
| 116（未知） | 是 |
| 142（未知） | 是 |
| 603（未知） | 是 |
| 644（未知） | 是 |
| 821（未知） | 是 |
| 822（未知） | 是 |
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