研究簡介
根尖性牙周炎主要由口腔微生物感染引發(fā)，并與多種危險因素有關。雖然，作為根尖牙周炎治療的主流，根管治療（RCT）可能會失敗并導致治療后牙髓病。隨機對照試驗中存活的微生物是PTED的主要原因（Siqueira和Rocas，2009年）。糞腸球菌因其高達77%的高檢測頻率而被認為是PTED的主要病原體（.根管治療后的牙髓?。≒TED）是根管治療失敗的主要表現(xiàn)，糞腸球菌和白色念珠菌是PTED中最常被檢出的微生物組合之一。以往研究表明這兩種微生物之間存在相互作用，但其具體機制尚不明確。
胞外囊泡（EVs）作為微生物間通訊的重要媒介，在調(diào)控病原體毒力、代謝過程和耐藥性等方面發(fā)揮關鍵作用。本研究旨在探討白色念珠菌來源的EVs對糞腸球菌生長和致病性的影響。研究通過超速離心法從白色念珠菌ATCC 90028的培養(yǎng)上清液中提取EVs，并通過透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）和納米顆粒跟蹤分析（NTA）對其形態(tài)、尺寸和蛋白濃度進行鑒定。采用生長曲線、菌落形成單位計數(shù)、掃描電鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡等技術，系統(tǒng)評估了不同濃度EVs（0.156μg/mL和5μg/mL）對糞腸球菌浮游生長、生物膜形成、耐惡劣環(huán)境能力、牙本質小管侵入能力以及在牙膠尖上定植能力的影響。此外，還通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗和巨噬細胞感染模型，分析了EVs對糞腸球菌細胞侵襲性和細胞毒性的調(diào)控作用。本研究首次系統(tǒng)揭示了白色念珠菌EVs在調(diào)控糞腸球菌致病性中的雙重作用，為理解真菌-細菌跨界互作提供了新的分子機制。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
Bioscreen全自動生長曲線分析儀用于精確評估白色念珠菌胞外囊泡（EVs）對糞腸球菌（Enterococcus faecalis）浮游生長的影響。將糞腸球菌懸液（最終濃度為1×10^6 CFU/mL）與不同濃度的白色念珠菌EVs（0.039-5μg/mL）混合后，取200μL混合物接種于96孔板中。實驗設置以等量PBS處理的細菌作為對照組。板孔表面覆蓋100μL礦物油以防止蒸發(fā)，隨后將96孔板置于Bioscreen C Pro全自動生長曲線分析儀中，在37°C條件下連續(xù)培養(yǎng)24小時。Bioscreen全自動生長曲線分析儀以每小時自動測量各孔在600nm波長下的光密度（OD600）值，通過這種高頻次、自動化的監(jiān)測方式，獲得了糞腸球菌在不同濃度EVs處理下的完整生長動力學數(shù)據(jù)。這種實時監(jiān)測方式避免了傳統(tǒng)手工取樣可能帶來的污染和誤差，確保了數(shù)據(jù)的準確性和可重復性。
實驗結果
白假絲酵母EV是具有雙層膜的納米顆粒，峰徑分別為111.9和230 nm。EV對糞腸桿菌及其生物膜表現(xiàn)出復雜的影響;5μg/mL的EV顯示出抑制作用，而0.156μg/mL的EV促進其生長。EVs對糞腸桿菌毒力表現(xiàn)出一致的影響。值得注意的是，5μg/mL的EVs降低了糞腸桿菌對RAW264.7細胞的損傷，以及糞腸桿菌對巨噬細胞的侵襲能力和巨噬細胞吞噬后糞腸桿菌的細胞內(nèi)存活能力，而0.156μg/mL的EVs則具有完全相反的效果。白假絲酵母EVs對糞腸桿菌的體外生長和毒力具有雙重影響，表明白色念珠菌EV參與真菌-細菌通訊。此外，5μg/mL EVs在體外表現(xiàn)出的抑制作用可能提示一種控制糞腸桿菌的新藥物。
圖1、白色念珠菌ATCC 90028中EV的鑒定。(a)白色念珠菌EVs的透射電鏡。比例尺，100nm。(b)白色念珠菌EVs的掃描電鏡。比例尺，500納米。(c)通過納米顆粒追蹤分析(NTA)測量的白色念珠菌EV的大小分布范圍。紅色箭頭表示白色念珠菌EV。
圖2 、白色念珠菌EVs對浮游糞腸球菌具有雙重作用。(a)不同濃度的白色念珠菌EVs處理后糞腸球菌的生長曲線。(b)不同時間點白色念珠菌EVs對糞腸球菌的影響。(c)在預設時間點用不同濃度的EV處理的糞腸球菌CFU。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns，無顯著性。
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