DNA芯片分析
轉(zhuǎn)錄組研究使用惡臭假單胞菌芯片；該芯片包含5539個(gè)基因特異性寡核苷酸（50聚體），一式兩份點(diǎn)樣到γ-氨基硅烷處理的25×75 mm顯微鏡載玻片上，并通過紫外線和加熱固定。將惡臭假單胞菌DOT-T1E、T1E-18和T1E-PS28在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用于接種含或不含300μM吲哚的新鮮培養(yǎng)基；培養(yǎng)物在30°C孵育至660 nm處濁度達(dá)到0.5-0.6（指數(shù)期），收集細(xì)胞并立即進(jìn)行RNA提取。使用TRI試劑（Trizol）/BCP（1-溴-3-氯丙烷）法分離RNA，隨后制備熒光標(biāo)記的cDNA；雜交條件和數(shù)據(jù)收集按先前描述進(jìn)行。采用LOWESS強(qiáng)度依賴性歸一化方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，使用Almazen系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算P值，當(dāng)倍數(shù)變化≥2且P值≤0.05時(shí)，認(rèn)為基因差異表達(dá)。芯片數(shù)據(jù)已存入Array Express數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress），登錄號(hào)為E-MEXP-3819、3822、3823和3824。
流式細(xì)胞術(shù)HPF熒光實(shí)驗(yàn)
使用5μM熒光報(bào)告染料HPF，PMT（光電倍增管）電壓設(shè)置如下：E00（FSC）、360（SSC）和825（FL1）；使用FACSDiva 6.0軟件處理和分析流式數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞過夜培養(yǎng)后以1:1000稀釋到25 mL含5μM HPF的LB培養(yǎng)基中，燒瓶在避光搖床中30°C、200轉(zhuǎn)/分鐘孵育；在指數(shù)生長期早期添加抗生素（詳見結(jié)果部分），在添加藥物前（0時(shí)刻）和3小時(shí)后取樣；在這些時(shí)間點(diǎn)收集約10^7個(gè)細(xì)胞，洗滌一次并重懸于過濾后的PBS（pH 7.2）中，然后進(jìn)行熒光測量。
Bioscreen生長曲線分析
從添加10μg/mL利福平的LB平板上挑取新鮮培養(yǎng)的惡臭假單胞菌DOT-T1E和DOT-T1E-18單菌落，在液體LB培養(yǎng)基中30°C過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)物重懸于15 mL液體LB培養(yǎng)基中，調(diào)整至660 nm處吸光度為0.1。在微孔板的每個(gè)孔中加入190μL液體LB培養(yǎng)基或170μL大腸桿菌LK111過濾上清液（均添加200μg/mL氨芐西林），以及10μL重懸培養(yǎng)物；對于大腸桿菌上清液，添加20μL 10×LB培養(yǎng)基。陽性對照孔為接種DOT-T1E菌株的液體LB培養(yǎng)基，陰性對照孔為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。使用FP-1100-C型Bioscreen C MBR分析儀系統(tǒng)在30°C連續(xù)振蕩條件下監(jiān)測生長；在24小時(shí)內(nèi)，每60分鐘使用420-580 nm邊帶濾光片測量濁度。每個(gè)菌株對每種測試化合物至少進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)后目視檢查平板以驗(yàn)證結(jié)果。
實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）
RNA提取按先前描述進(jìn)行，實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增在MyiQ2系統(tǒng)上進(jìn)行，結(jié)合iQ5光學(xué)系統(tǒng)軟件（版本2.1.97.1001）。每個(gè)25μL反應(yīng)混合物包含12.5μL iQ SYBR綠色超混合液[100 mM KCl、40 mM Tris-HCl（pH 8.4）、0.4μM每種dNTP、iTaq DNA聚合酶（50 U/mL）、6 mM MgCl2、SYBR綠色I(xiàn)、20 nM熒光素和穩(wěn)定劑]、0.4μM每種引物和2μL模板cDNA（稀釋10倍或1000倍）。熱循環(huán)條件如下：95°C 10分鐘（1個(gè)循環(huán)），然后95°C 15秒、61.1°C或61.7°C（分別用于吲哚和氨芐西林實(shí)驗(yàn)）30秒、72°C 20秒（40個(gè)循環(huán)），每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光測量（按制造商建議）；最后進(jìn)行72°C 1分鐘的延伸循環(huán)。PCR產(chǎn)物長度在132-350 bp之間；熔解曲線分析通過將PCR混合物從55°C逐步加熱至95°C（每10秒升溫0.5°C，共80個(gè)循環(huán)）進(jìn)行?；虻南鄬Ρ磉_(dá)水平以16S rRNA為內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化，結(jié)果采用比較閾值循環(huán)（ΔΔCt）法分析。
結(jié)果
利用熒光染料分析惡臭假單胞菌對抗生素的響應(yīng)
在惡臭假單胞菌DOT-T1E菌株中，某些殺菌化合物（氨芐西林、諾氟沙星）和抑菌化合物（氯霉素、四環(huán)素、紅霉素）的主要排出機(jī)制是通過RND外排泵實(shí)現(xiàn)的。本研究監(jiān)測了野生型惡臭假單胞菌DOT-T1E及其ttgABC敲除突變體（T1E18）、ttgGHI敲除突變體（T1E-PS28）和雙突變體ttgABC/ttgGHI（T1E-PS32）（表1）在暴露于氨芐西林、諾氟沙星（殺菌化合物）以及氯霉素、紅霉素、四環(huán)素（抑菌抗生素）后的細(xì)胞生長停滯、細(xì)胞死亡和3'-對羥基苯基熒光素（HPF）熒光淬滅情況。
首先，我們測定了四種菌株對上述五種抗生素的最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果顯示，T1E-PS28的MIC與野生型DOT-T1E一致（表2），而兩種TtgABC缺陷菌株（T1E-18和T1E-PS32）對抗生素的敏感性顯著提高（表2）。對于抑菌化合物，300μg/mL氯霉素、400μg/mL紅霉素或8μg/mL四環(huán)素可抑制野生型菌株生長，但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中（3小時(shí)）細(xì)胞存活率保持100%（氯霉素的結(jié)果見圖1A）；對于TtgABC突變體，70μg/mL氯霉素即可抑制生長，而雙突變體在更低濃度下生長就會(huì)受到抑制（表2），但實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞仍存活。
對于殺菌化合物，這類抗生素首先抑制細(xì)胞生長，3小時(shí)后由于細(xì)胞裂解，存活細(xì)胞數(shù)量減少兩個(gè)數(shù)量級。親本菌株DOT-T1E和PS28菌株在625μg/mL氨芐西林或2μg/mL諾氟沙星作用下表現(xiàn)出上述效應(yīng)；T1E-18和T1E-PS32在更低濃度的這兩種殺菌化合物作用下即可停止生長，隨后發(fā)生細(xì)胞死亡。
吲哚是TtgV的效應(yīng)物，而TtgV是調(diào)控ttgGHI表達(dá)的抑制子。我們推測，由于TtgGHI泵參與抗生素排出，吲哚存在時(shí)惡臭假單胞菌DOT-T1E的抗生素耐藥性可能增強(qiáng)。我們在有吲哚存在的條件下，對親本菌株及ttgABC、ttgGHI和ttgABC/ttgGHI突變體重復(fù)了MIC實(shí)驗(yàn)（見表2）。結(jié)果顯示，DOT-T1E和T1E-PS28（ttgGHI突變體）在有無吲哚存在時(shí)的抗生素耐藥模式相似，無顯著差異（表2）；T1E-PS32雙突變體在有無吲哚存在時(shí)均比親本菌株對抗生素的耐藥性更低；而T1E-18菌株在吲哚存在時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗生素耐藥性，這表明在缺乏TtgABC的情況下，吲哚依賴性TtgGHI誘導(dǎo)對耐藥性具有重要作用。
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