討論
乳酸乳球菌IL1403的claR基因產(chǎn)物屬于RpiR家族的潛在調(diào)控因子，該家族成員在許多其他相關(guān)或遠(yuǎn)緣細(xì)菌屬中大量存在（http://www.kegg.jp/kegg/ssdb/）。最強(qiáng)的ClaR直系同源物僅在其他乳酸球菌物種中發(fā)現(xiàn)（例如，乳酸乳球菌亞種cremoris MG1363和SK11，以及乳酸乳球菌亞種lactis KF147）。在乳酸乳球菌IL1403基因組中編碼了八個(gè)來(lái)自RpiR家族的旁系同源物（由yidA、yecA、yljC、yfeA、yugA、gntR和yleF編碼），其中ClaR是原型例子。迄今為止，尚未將功能分配給乳酸乳球菌中任何RpiR家族基因。
然而，在許多不同細(xì)菌物種中發(fā)現(xiàn)的ClaR直系同源物的保守性表明在宿主生物中具有重要作用。實(shí)際上，已顯示RpiR家族的少數(shù)成員作為參與不同碳源代謝的基因的正向或負(fù)向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮作用。例如，在枯草芽孢桿菌中，麥芽糖代謝受到GlvR的正向調(diào)控。到目前為止，GlvR是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌組中表征的RpiR調(diào)控因子家族的唯一代表。所有其他功能表征的例子都來(lái)源于革蘭氏陰性細(xì)菌，其中RpiR家族調(diào)控因子似乎下調(diào)基因表達(dá)。這些RpiR樣阻遏物已被證明在大腸桿菌中調(diào)控核糖和N-乙酰muramic acid的代謝，在惡臭假單胞菌中調(diào)控葡萄糖代謝，以及在柄桿菌、腸道沙門(mén)氏菌和苜蓿中華根瘤菌中調(diào)控肌醇代謝。RpiR家族成員在其N(xiāo)端包含一個(gè)HTH基序，在其C端包含一個(gè)SIS結(jié)構(gòu)域。SIS結(jié)構(gòu)域是在許多調(diào)控磷酸糖合成基因表達(dá)的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的磷酸糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
有理由推測(cè)這種類(lèi)型的調(diào)控在乳酸乳球菌IL1403中起作用；理論上，通過(guò)CelB進(jìn)入IL1403細(xì)胞后磷酸化的纖維二糖或乳糖與ClaR的SIS結(jié)構(gòu)域結(jié)合。這種結(jié)合可能導(dǎo)致ClaR調(diào)控因子的刺激，并允許其結(jié)合到相應(yīng)的DNA區(qū)域，從而導(dǎo)致ClaR依賴(lài)的基因表達(dá)調(diào)控。我們假設(shè)通過(guò)這種機(jī)制，在纖維二糖或乳糖存在下，可以激活bglS、celB和ptcBA的表達(dá)。證實(shí)這一假設(shè)的證據(jù)包括觀(guān)察到在纖維二糖存在下，claR突變體生長(zhǎng)時(shí)，由于ClaR缺失，bglS、celB以及較小程度的ptcBA mRNA水平顯著降低（表2）。當(dāng)半乳糖或葡萄糖作為唯一碳源存在時(shí)，未觀(guān)察到這種效應(yīng)，表明這些糖對(duì)ClaR沒(méi)有激活作用。
此外，ClaR在乳糖和纖維二糖代謝中起作用的假設(shè)得到了claR突變體在纖維二糖和/或乳糖補(bǔ)充培養(yǎng)基中生長(zhǎng)缺陷的有力證實(shí)（圖2a-c）。在IL1403△ccpA△claR菌株中缺失ccpA導(dǎo)致其在纖維二糖補(bǔ)充培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)部分恢復(fù)，但在乳糖補(bǔ)充培養(yǎng)基中則沒(méi)有（圖2a-c）。因此，可以合理地得出結(jié)論，由于缺乏bglS和celB的轉(zhuǎn)錄，這兩種突變體幾乎或完全不能利用這些糖，而bglS和celB的轉(zhuǎn)錄是PTSCel-Lac功能所必需的。
當(dāng)通過(guò)表型微陣列和API 50CH測(cè)試進(jìn)行全局評(píng)估時(shí)，在測(cè)試的數(shù)十種不同碳源中，未檢測(cè)到claR缺失菌株與親本菌株之間的進(jìn)一步表型差異，這證實(shí)了ClaR的狹窄但顯著的特異性。IL1403△claR在纖維二糖上幾乎無(wú)法生長(zhǎng)（圖2a），同時(shí)在該糖上能有效呼吸（當(dāng)通過(guò)表型微陣列測(cè)試時(shí)），這種矛盾現(xiàn)象可以通過(guò)IL1403中纖維二糖代謝的命運(yùn)來(lái)解釋。先前，我們表明EIIC CelB通透酶是乳酸乳球菌IL1403中纖維二糖和乳糖攝取的唯一專(zhuān)用蛋白，而B(niǎo)glS是乳糖水解的關(guān)鍵糖苷酶。盡管纖維二糖也是BglS的底物，但推測(cè)IL1403中可能存在一種或多種能夠水解這種糖的額外酶，并且可能受到CcpA介導(dǎo)的負(fù)調(diào)控。此外，本研究的結(jié)果清楚地表明，bglS的轉(zhuǎn)錄緊密依賴(lài)于ClaR的激活，而celB的轉(zhuǎn)錄在較小程度上依賴(lài)于ClaR的激活（表2）。因此，我們可以假設(shè)在IL1403△claR中，仍然存在少量CelB，可能轉(zhuǎn)運(yùn)痕量的乳糖或纖維二糖。在IL1403△claR中內(nèi)化的乳糖由于缺乏BglS（由ClaR缺失導(dǎo)致）不能作為能源。另一方面，在IL1403△claR中，通過(guò)CelB攝取纖維二糖以及不同于BglS的水解酶活性形成的纖維二糖衍生代謝物量很少，不足以進(jìn)行有效的突變體細(xì)胞分裂，導(dǎo)致突變體生長(zhǎng)受限。
本研究通過(guò)RT-qPCR確定的結(jié)果表明，在所有測(cè)試條件下（在不同糖存在下[表2]以及在CcpA蛋白存在或缺失下[數(shù)據(jù)未顯示]），claR均以低水平弱表達(dá)，其相對(duì)基因表達(dá)水平僅略高于零。這與許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子內(nèi)源性以低量存在的事實(shí)一致，就ClaR而言，這可能是由于幾個(gè)原因。首先，在claR基因上游發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)推定啟動(dòng)子與-10和-35序列的共有位點(diǎn)均顯示不完全相關(guān)性，因此可能驅(qū)動(dòng)低水平轉(zhuǎn)錄。其次，這些推定啟動(dòng)子之一產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本起始于rho非依賴(lài)型終止子序列上游（圖1b，c），這可能過(guò)早終止claR轉(zhuǎn)錄。我們證明它是一個(gè)中等強(qiáng)度的終止子，因?yàn)樗约s60%的效率阻止了claR的轉(zhuǎn)錄。因此，可以假設(shè)覆蓋claR基因的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的生成可能是通過(guò)少量通讀轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。然而，我們不能排除未知抗終止因子影響下通讀終止效率可能增強(qiáng)的可能性。
盡管ClaR在糖代謝背景下的特異性狹窄，但其調(diào)控的基因在乳酸乳球菌菌株棲息的生態(tài)系統(tǒng)——植物材料（纖維二糖）和乳汁（乳糖）——中非常重要。擁有這樣的調(diào)控因子允許其定居更多樣化的環(huán)境，從而賦予乳酸乳球菌相對(duì)于其他微生物的優(yōu)勢(shì)。ClaR蛋白前所未有的作用使其更加重要，因?yàn)槿樘呛挺?葡萄糖苷的代謝對(duì)于涉及乳酸乳球菌的生物技術(shù)過(guò)程具有巨大的經(jīng)濟(jì)重要性，涉及發(fā)酵乳制品和植物產(chǎn)品的生產(chǎn)。獲得與乳酸乳球菌中糖代謝及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的詳細(xì)知識(shí)可能有助于改進(jìn)控制這些細(xì)菌中重要細(xì)胞過(guò)程的機(jī)制。對(duì)于像乳酸乳球菌這樣的工業(yè)微生物，修改明確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能會(huì) drastically 影響細(xì)菌的特性并對(duì)生物過(guò)程產(chǎn)生影響。最后，我們可以假設(shè)通過(guò)我們的研究，我們可以引入乳酸球菌菌株代謝潛力的變化，這些菌株本身不能同化乳糖。我們可以通過(guò)失活ccpA或通過(guò)添加纖維二糖激活其他基因來(lái)啟動(dòng)這一過(guò)程。與質(zhì)粒定位的lac操縱子相反，編碼PTSCel-Lac組分的基因位于染色體上，這確保了它們的穩(wěn)定性，這是工業(yè)應(yīng)用的一個(gè)潛在重要特征。
相關(guān)新聞推薦
2、不同濃度二氧化氯對(duì)果膠桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)、存活率的影響（二）
3、污水處理中常見(jiàn)的微生物生長(zhǎng)條件