通過Box-Behnken優(yōu)化培養(yǎng)基組成
根據(jù)上述結果，選擇顯著自變量[即蛋白胨（X1）、葡萄糖（X2）和MnSO4·H2O（X3）]用于Box-Behnken設計。相應的實驗數(shù)據(jù)如表4所示。結果通過標準方差分析（ANOVA）進行分析，如表S1所示。模型的充分性通過確定系數(shù)評估。該模型呈現(xiàn)相對較高的F值（2522.51）、非常低的概率值（P>F=0.0001）和高系數(shù)（R2=0.9997），解釋99.97%的響應變異性。X1、X2和X3的最佳濃度分別為25 g/L、24.86 g/L和0.2 g/L，導致最大理論OD600為1.78（表4）。為確認這些結果，在預測培養(yǎng)基條件下進行了額外的獨立實驗，重復三次，生物量平均值為1.772，與預測值一致。該優(yōu)化策略使生物量從OD600 1.611提高至1.772。
MRS中微量元素對細胞生長的影響
根據(jù)表3中正交實驗設計的ANOVA分析，MRS培養(yǎng)基中的許多微量元素，如K2HPO4、CH3COONa、MgSO4和檸檬酸銨，被認為對鼠李糖乳桿菌ZY的生物量沒有顯著影響。因此，進一步研究了從MRS培養(yǎng)基中簡單去除這些微量元素的經(jīng)濟策略。實驗設計如表5所示，針對以下培養(yǎng)基組成：原始MRS、OPT、無檸檬酸銨、或無K2HPO4、或無CH3COONa、或無MgSO4、以及無MRS中四種元素（mini-MRS）。微量元素對特定生長速率和最大生物量的影響如表5所示。顯著影響特定生長速率的關鍵微量元素排序為：檸檬酸銨 > CH3COONa > MgSO4和K2HPO4。最后，在mini-MRS中發(fā)生最小OD600為1.339，其中去除了所有四種微量元素。如圖2所示，鼠李糖乳桿菌ZY在6小時前的早期階段在各種條件下生長相似。最后，在MRS、OPT和mini-MRS培養(yǎng)基中顯示出生物量和特定生長速率的主要差異。這表明單個微量元素對細胞生長的影響略微顯著，而總微量元素或含有補充來源也顯著參與乳桿菌代謝。
細胞表面表征和蛋白質分析
代表在不同發(fā)酵條件下生長的細菌細胞的ATR-FTIR光譜。大分子功能群對應的吸收帶分配總結在表S2中。在樣本中，在光譜的碳水化合物區(qū)域（1200-950 cm-1）以及對應于磷酸鹽（~1225 cm-1）拉伸、酰胺I和II帶中C=O和C-N基團的區(qū)域觀察到細微差異。這些結果表明細胞表面成分發(fā)生構象變化。然而，在不同培養(yǎng)條件下處理的樣本中未觀察到鼠李糖乳桿菌ZY表面特性的明顯影響。據(jù)報道，發(fā)酵特性（包括生長培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度和pH）也影響細胞產量和細胞特性。因此，本研究采用FTIR光譜技術，該技術通過先進的化學計量學技術系統(tǒng)革新，從高光譜數(shù)據(jù)中提?。ㄉ铮┗瘜W信息，以研究培養(yǎng)基對鼠李糖乳桿菌ZY表面特性的影響。
此外，總細胞蛋白質的SDS-PAGE分析，隨后進行聚類分析，如圖4所示。這些結果表明，鼠李糖乳桿菌ZY在6小時具有相似的蛋白質模式，這與MRS、OPT和mini-MRS培養(yǎng)基在早期生長階段的特定生長速率一致（圖2），而三種條件下24小時的蛋白質譜不同。選擇條帶10作為Quantity One分析的內部標準，隨后使用PermutMatrix軟件進行雙向層次聚類分析。如圖4B所示，條帶6、17和18對應于來自MRS培養(yǎng)的ZY菌株中的不同蛋白質（即黑色和紅色條帶）。條帶6的蛋白質在MRS中明顯顯示比OPT和mini-MRS培養(yǎng)條件下濃度更高，而條帶17和18的蛋白質濃度在OPT培養(yǎng)基中略高。因此，通過MALDI-TOF-TOF進一步分析四種選定蛋白質。詳細的Mascot鑒定信息（表6）表明，通過質譜鑒定的蛋白質6是分子伴侶DnaK，蛋白質10是伴侶蛋白GroEL，蛋白質17是塔格糖-1,6-二磷酸醛縮酶，蛋白質18是30S核糖體蛋白S2。MRS培養(yǎng)基中的差異蛋白DnaK協(xié)助新生多肽鏈折疊和錯誤折疊蛋白質重折疊。關于塔格糖-1,6-二磷酸醛縮酶和核糖體蛋白，這些蛋白質受環(huán)境條件高度調控，以有效利用碳源，例如通過利用OPT培養(yǎng)基中更大量的葡萄糖。由于串聯(lián)質譜技術可用于從復雜培養(yǎng)條件中發(fā)現(xiàn)差異蛋白質，并從新菌株中發(fā)現(xiàn)新酶，我們的結果通過這種替代蛋白質組學方法初步確定MRS培養(yǎng)基中對乳桿菌關鍵的成分是與碳源濃度相關的那些。通過轉錄水平檢測關鍵因素濃度影響細胞生長的進一步研究是必要的。
結論
本研究通過正交實驗設計成功解析了MRS培養(yǎng)基中各成分對鼠李糖乳桿菌ZY生長的影響，確定了葡萄糖、MnSO4·H2O和牛肉浸膏為最關鍵因素。通過Box-Behnken設計優(yōu)化后，生物量從OD600 1.611顯著提高至1.772。研究還發(fā)現(xiàn)，雖然單個微量元素對生長影響不顯著，但完全去除微量元素會顯著抑制生長。FTIR和蛋白質組學分析表明，不同培養(yǎng)基條件會影響細胞表面特性和蛋白質表達，特別是與碳源利用相關的蛋白質。這些發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化乳桿菌培養(yǎng)條件提供了重要理論基礎和實踐指導。
相關新聞推薦
1、不同pH、Na2CO3、NaCl濃度對耐鹽堿菌株NM-1生長曲線的影響——材料與方法
3、不同硝酸鹽濃度下渤海和黃海聚球藻生長曲線、色素含量變化——材料與方法