1、材料與方法
1.1樣品采集與富集培養(yǎng)
原位聚球藻于2020年8月在渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位采集。利用CTD采樣器(Sea-Bird 911Plus，Sea-Bird，美國)采集2~5 m水深的海水100 mL，經(jīng)48μm篩絹預(yù)過濾后用3μm針管過濾器過濾至含放線菌酮(0.05 mg·mL–1)的50 mL SNAX培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)條件為:溫度25℃，光照強度50μmol·m–2·s–1，光照周期12D:12L。
1.2培養(yǎng)實驗方法
在無菌條件下，分別將100 mL的富集培養(yǎng)藻液B12和H19于7 386 r/min、4℃條件下離心20 min，接種于無氮組分海鹽(Aquavitro，美國?；?配制的1 L改良的SNAX培養(yǎng)基中(硝酸鹽濃度為實驗組濃度，銨鹽濃度為1.0μmol·L–1，其余成分濃度不變)。參照實際海域營養(yǎng)鹽狀況，實驗設(shè)置4個硝酸鹽濃度組，分別為0.1、1.0、10.0、100.0μmol·L–1，每個實驗組設(shè)置3個平行。實驗從第6 d開始采取半連續(xù)培養(yǎng)方式，每間隔24 h從培養(yǎng)瓶中取出250 mL培養(yǎng)基并補充250 mL新鮮培養(yǎng)基。實驗持續(xù)15 d，期間每24 h測定藻細胞密度，至實驗結(jié)束測定聚球藻的色素含量、光合作用參數(shù)以及體系中的碳氮含量。
1.3分析測定方法
1.3.1聚球藻富集樣品的鑒定
取富集樣品1.40 mL，加入多聚甲醛(終濃度為0.5%)固定后，采用流式細胞儀(BD FACS Jazz，美國)根據(jù)前向散射光(FSC)、側(cè)向散射光(SSC)、葉綠素a(FL-1，488 nm)、藻紅蛋白(FL-2，585 nm)和藻藍蛋白(FL-3，640 nm)熒光信號鑒定聚球藻及其色素類型。另取500 mL富集樣品過濾至0.22μm聚碳酸酯濾膜(Millipore Co.，美國)，采用高通量測序分析聚球藻的系統(tǒng)發(fā)育分類。具體方法為使用DNA快速提取試劑盒(Fast DNAspin kit，MP BIO，美國)抽提DNA，以聚球藻特異性引物rpoC1-39F/rpoC1-462R擴增RNA聚合酶γ亞單位編碼基因。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;35個循環(huán)(95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s);72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物在Majorbio有限公司(上海，中國)使用PE300 Illumina MiSeq測序平臺進行測序。序列經(jīng)fastp v0.20.0質(zhì)控，F(xiàn)LASH v1.2.7拼接后，使用UPARSE v7.1剔除嵌合體，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相似序列比對并以原綠球藻的PCC9511為外群，采用最大似然法用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。原始數(shù)據(jù)保存至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(序列號:SAMN26533762-SAMN26533769)。
1.3.2藻細胞密度測定
采用流式細胞術(shù)測定聚球藻細胞密度，方法同1.3.1。參照文獻方法計算聚球藻細胞的比生長速率和最大比生長速率。
1.3.3葉綠素a和藻膽蛋白含量測定
取藻液40 mL，用甲醇法提取葉綠素a(Chl a)后，用分光光度計(Lambda 25，PerkinElmer，美國)根據(jù)665 nm和652 nm處的吸光值計算葉綠素a濃度。另取藻液40 mL，用超聲破碎法提取藻膽蛋白，以PBS緩沖液為空白，測定565 nm、620 nm和650 nm處的吸光值，按照公式(1-3)計算分別藻藍蛋白(PC)、別藻藍蛋白(APC)和藻紅蛋白(PE)的濃度。
式中，A620、A650和A565分別表示620、650和565 nm處的吸光值，cPC、cAPC和cPE分別表示PC、APC和PE的濃度(mg·mL–1)。
1.3.4光合生理參數(shù)測定
取藻液3 mL，暗適應(yīng)15 min后使用Aqua Pen手持式藻類葉綠素?zé)晒鈨x(WALZ，德國)測量量子產(chǎn)率(Qy)和最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)值。測量光、飽和脈沖光及光化光分別設(shè)置為0.018、1 800和600μmol·m–2·s–1。
1.3.5營養(yǎng)鹽及碳、氮含量測定
取藻液10 mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾至10 mL離心管中，利用連續(xù)流動分析儀(AA3，Seal Analytical，德國)測定銨鹽(NH4+)，硝酸鹽(NO3–)，亞硝酸鹽(NO2–)和磷酸鹽(PO43–)的濃度。另取藻液10 mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾至酸洗棕色玻璃瓶中，利用全自動總有機碳分析儀(TOC-VCPH，Shimadzu，日本)測定總有機碳(TOC)、總無機碳(TIC)和總氮(TN)的含量。
1.4數(shù)據(jù)分析
使用FlowJo 10.6.2軟件分析流式細胞儀獲得的數(shù)據(jù)，使用Origin 2018進行繪圖，使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗，設(shè)置顯著性水平為P<0.05。
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