摘要
通過使用特定的半固體培養(yǎng)基和分光光度計(jì)/比濁測量方法，結(jié)合Bioscreen C的2x100微孔板，開發(fā)了一種快速篩選抗真菌化合物和進(jìn)行絲狀真菌生態(tài)生理學(xué)研究的方法。培養(yǎng)基組成和制備、接種物大小、培養(yǎng)基體積以及用于測量初始萌發(fā)和生長動態(tài)的培養(yǎng)參數(shù)均已優(yōu)化。這些方法已應(yīng)用于評估18種濃度丙基丙烷硫代亞磺酸酯（PTS）在YES培養(yǎng)基中對黃曲霉（Aspergillus flavus）在不同環(huán)境條件下的有效性。在四種不同環(huán)境條件（水活度0.995和0.95；溫度20°C和25°C）下，通過7天周期內(nèi)每20分鐘自動測量，計(jì)算了最小抑制濃度（MIC）、非抑制濃度（NIC）和新開發(fā)的MIC50。數(shù)據(jù)使用Lambert-Pearson模型進(jìn)行建模，這是一種先前用于細(xì)菌抑制的數(shù)學(xué)建模方法。結(jié)果已與傳統(tǒng)生長速率數(shù)據(jù)和半致死劑量（LD50）值進(jìn)行比較。這種方法可能對絲狀生物的生長和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的快速篩選assay產(chǎn)生重大影響，并在時(shí)間減少、所需培養(yǎng)基體積、測量以及整合和建模關(guān)鍵參數(shù)以比較效能方面具有主要優(yōu)勢。
引言
確保食品微生物質(zhì)量和安全的需求促進(jìn)了預(yù)測建模在量化和預(yù)測微生物行為方面的興趣（Lahlali等人，2005）。特別令人關(guān)注的是不同環(huán)境因素和防腐劑對生長前滯后期和生長速率的影響。由于絲狀真菌的生長習(xí)性，尤其是產(chǎn)毒菌種，進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)更為困難，因此環(huán)境因素相互作用對生長和邊界條件影響的建模研究較細(xì)菌受到較少關(guān)注（Garcia等人，2009）。
真菌活性（包括孢子萌發(fā)、生長和孢子形成）的量化是復(fù)雜的，因?yàn)檎婢ㄟ^菌絲在基質(zhì)中定殖。真菌產(chǎn)生菌絲生物量，其重量僅在生長早期階段呈指數(shù)增加（Koch，1975），以及它們不是單細(xì)胞，并能在三維空間中擴(kuò)散和穿透食品基質(zhì)，使得生長量化和建模困難（Gibson&Hocking，1997；Dantigny等人，2005）。這些障礙導(dǎo)致使用菌絲延伸速率（如徑向生長速率）作為最常見的方法，基于Trinci（1971）的工作。然而，這些測量并不代表真菌生長的真實(shí)三維性質(zhì)。
研究環(huán)境因素（培養(yǎng)基、水可用性、溫度）和篩選抗真菌化合物（尤其是食品腐敗產(chǎn)毒真菌）的生態(tài)生理學(xué)研究通常使用基于瓊脂的平皿系統(tǒng)傳統(tǒng)測量方法（Marin等人，1995；Medina等人，2007；Judet等人，2008）。這些多因素實(shí)驗(yàn)通常需要長時(shí)間、大量重復(fù)平皿，并需要定期測量菌落直徑。
在大多數(shù)情況下，絲狀真菌的生長動力學(xué)是從菌絲延伸速率計(jì)算的。對于抗真菌效能，這些數(shù)據(jù)然后用于計(jì)算相對于對照抑制50%（LD50）和90%（LD90）生長的致死劑量（Aldred等人，2008；Kumar等人，2010）。這通常只允許測試少量濃度，并需要插值，假設(shè)響應(yīng)是線性的。
基于比濁測量的分光光度法assay方法已在少量真菌生長研究中使用（Schnurer，1993；Rossi-Rodrigues等人，2009）。這些研究主要在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（Van Eldere等人，1996；Meletiadis等人，2001a，2001b；Meletiadis等人，2003），并用于開發(fā)分生孢子形成真菌的體外抗真菌敏感性測試；這提供了快速結(jié)果，以光密度（O.D.）單位表示。
使用比濁測量獲得的數(shù)據(jù)已被許多作者用于計(jì)算兩個(gè)對食品工業(yè)和評估目的特別感興趣的特定濃度。這涉及獲取非抑制濃度（NIC）和最小抑制濃度（MIC）在特定環(huán)境條件下的信息（Lambert&Pearson，2000）。此類絲狀真菌研究通常持續(xù)24至48小時(shí)（Schnurer，1993；Meletiadis等人，2001a，2001b；Rossi-Rodrigues等人，2009）。據(jù)我們所知，尚未有更長期研究的描述。問題通常是較長培養(yǎng)期導(dǎo)致生長曲線不規(guī)則，并且因?yàn)榍€下面積（AUC）是用于計(jì)算參數(shù)。這一限制使得該技術(shù)不適合絲狀真菌生長的擴(kuò)展生態(tài)生理學(xué)研究。
Lambert&Pearson（2000）和Lambert&Lambert（2003）的研究導(dǎo)致了適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)工具開發(fā)，用于計(jì)算單一和混合抑制劑對細(xì)菌的MIC和NIC值。Lambert-Pearson模型（LPM）（方程（1））已成功用于O.D.（Lambert&Pearson，2000；Lambert&Lambert，2003；Bidlas&Lambert，2008）和阻抗微生物測量（Chorianopoulos等人，2006）。這種數(shù)學(xué)方法使用檢測時(shí)間（TTD）計(jì)算MIC（方程（2））和NIC（方程（3）），這使得計(jì)算獨(dú)立于實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
其中RTD是檢測速率（1/TTD），x是抑制劑濃度，P0是最優(yōu)RTD值，P1和P2是最大斜率濃度（在對數(shù)濃度軸上）和斜率參數(shù)，e是指數(shù)，約等于2.718。
本研究的目標(biāo)是（1）開發(fā)一種自動比濁讀數(shù)器方法檢查黃曲霉的萌發(fā)和初始生長動態(tài)，（2）使用所提出的方法結(jié)合LPM準(zhǔn)確定量評估抗真菌化合物在不同環(huán)境條件下對黃曲霉的MIC和NIC。
材料和方法
真菌菌株和培養(yǎng)基
使用一株產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株（NRRL 3357），由美國農(nóng)業(yè)部（USDA）新奧爾良的D.Bhatnagar博士提供。該菌株在麥芽提取物瓊脂（20克麥芽提取物（Difco），2克蛋白胨（Difco），15克瓊脂（Sigma-Aldrich，多塞特，英國））上于25°C黑暗培養(yǎng)7天。使用YES瓊脂培養(yǎng)基，含酵母提取物20克/升，蔗糖150克/升和硫酸鎂0.5克/升。用于制備培養(yǎng)基的水用甘油修改至所需水活度水平（aw；0.995和0.95）。
化學(xué)品
丙基丙烷硫代亞磺酸酯（PTS）（圖1），一種從大蒜球莖（Allium sativum）中初始化合物分解獲得的有機(jī)磺酸鹽，由DMC研究中心S.L.，格拉納達(dá)，西班牙（X.Paris博士）提供。儲備溶液通過將純PTS稀釋在80%乙醇水溶液（v/v）中制備。工作標(biāo)準(zhǔn)系列在每次實(shí)驗(yàn)前制備，以便所有培養(yǎng)基接種相同量的乙醇。不含PTS的80%乙醇溶液在YES培養(yǎng)基中用作對照培養(yǎng)基。
比濁assay
濁度分析使用Bioscreen C微生物生長分析儀（Labsystems，赫爾辛基，芬蘭）。非標(biāo)準(zhǔn)100孔微孔板專為此機(jī)器制造，加載先前接種黃曲霉孢子懸浮液的不同培養(yǎng)基。O.D.使用600納米濾光片每20分鐘記錄一次，持續(xù)7天。數(shù)據(jù)使用制造商提供的軟件Easy Bioscreen Experiment（EZExperiment）記錄，然后導(dǎo)出到Microsoft®Excel®Professional 2010（14.0.4756.1000）（Microsoft Corporation，雷德蒙德，華盛頓，美國）表格進(jìn)行進(jìn)一步分析。實(shí)驗(yàn)在20°C或25°C下進(jìn)行。
培養(yǎng)基制備和瓊脂濃度優(yōu)化
使用YES培養(yǎng)基。使用純水，測試六種不同瓊脂濃度（2-0.05%w/v）。培養(yǎng)基在121°C高壓滅菌20分鐘。之后，培養(yǎng)基搖動并在室溫下完全冷卻。培養(yǎng)基（300μl）使用多通道移液器倒入100孔微孔板（每種瓊脂濃度十個(gè)孔）。Bioscreen C在25°C下運(yùn)行45小時(shí)。
選擇適當(dāng)接種物大小
使用在YES瓊脂培養(yǎng)基上生長的黃曲霉菌株（7天，25°C）制備含1.1x10^8孢子/毫升的孢子懸浮液，在0.05%Tween 80鹽溶液中。制備系列稀釋以獲得從10^3到10^7孢子/毫升的不同孢子濃度。這些溶液用于接種半固體YES培養(yǎng)基（含先前部分最佳瓊脂濃度），濃度范圍從10^2到10^6孢子/毫升。然后培養(yǎng)基使用多通道移液器倒入100孔微孔板。每種處理使用十個(gè)重復(fù)。
選擇適當(dāng)體積
半固體YES培養(yǎng)基（0.125%瓊脂w/v）接種黃曲霉孢子懸浮液以獲得最終濃度1x10^5孢子/毫升，使用不同體積（200至400μl）加載到100孔微孔板孔中。每種條件使用十個(gè)重復(fù)。
不同O.D.值下生物量計(jì)算
獲得兩個(gè)含1x10^6和1x10^8孢子/毫升的孢子溶液。使用兩組半固體YES培養(yǎng)基（40毫升）接種微孔板，每孔加入400μl一種孢子懸浮液，給出最終濃度1x10^4和1x10^6孢子/毫升。微孔板五十孔填充每種混合物，然后在25°C培養(yǎng)。
培養(yǎng)13、14、15、16和17小時(shí)后，記錄O.D.，并使用無菌1毫升注射器將十孔內(nèi)容物提取到預(yù)稱重的塑料離心管中。菌絲和孢子通過添加3毫升無菌雙蒸水洗滌四次，搖動后，以6000 rpm離心20分鐘。之后，管在無菌流動柜中干燥，再次記錄重量。通過減去原始管重量計(jì)算存在的生物量。
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