使用質(zhì)粒pJL84構(gòu)建針對(duì)fruA(PfruA-cat)、levD(PlevD-cat)和manL(PmanL-cat)啟動(dòng)子的CAT報(bào)告基因融合，方法是將包含啟動(dòng)子的DNA片段（包括同源核糖體結(jié)合位點(diǎn)）插入到缺乏核糖體結(jié)合位點(diǎn)的金黃色葡萄球菌無啟動(dòng)子cat基因前面。通過SphI和SacI限制性酶切釋放啟動(dòng)子-cat融合片段，并亞克隆到整合載體pMJB8中，該載體允許將DNA插入片段以單拷貝形式遞送到戈登氏鏈球菌染色體上的gtfG基因中。所有基因融合在轉(zhuǎn)化戈登氏鏈球菌前均通過DNA測(cè)序確認(rèn)，并通過PCR確認(rèn)所得分離株中整合盒的正確構(gòu)型。
生化測(cè)定。細(xì)菌培養(yǎng)物在補(bǔ)充了各種碳水化合物的30 ml TV基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)中期，通過離心收集細(xì)胞，用相同體積的10 mM Tris緩沖液(pH 7.8)洗滌一次，重懸于750μl相同緩沖液中，然后在Bead Beater(Biospec Products,Bartlesville,OK)中均質(zhì)化30秒，兩次，間隔冰上2分鐘。在4°C下以18,000 x g離心10分鐘后，回收上清液用于通過Shaw的方法測(cè)量CAT活性。裂解液的蛋白質(zhì)濃度通過Bradford(Bio-Rad)或二辛可寧酸(BCA;Thermo Scientific)測(cè)定法確定。CAT活性表示為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)乙?；穆让顾丶{摩爾數(shù)。
PEP依賴性PTS測(cè)定根據(jù)別處描述的方案進(jìn)行，略有修改。簡(jiǎn)言之，在含有0.5%指定碳水化合物的TV基礎(chǔ)培養(yǎng)基中厭氧生長(zhǎng)的30 ml培養(yǎng)物在指數(shù)晚期（600 nm光密度[OD600]=0.5至0.6）收獲，用30 ml含有5 mM MgCl2的100 mM Na-K-PO4緩沖液(pH 7.2)洗滌兩次，重懸于1 ml相同緩沖液中，然后通過渦旋振蕩與50μl甲苯-丙酮(1:9,體積比)處理2分鐘（兩次，間隔冰上2分鐘）進(jìn)行透化處理。在這些測(cè)定中使用厭氧生長(zhǎng)的細(xì)胞，因?yàn)榇嬖谘醯那闆r下生長(zhǎng)的細(xì)胞具有高水平的NADH自發(fā)氧化，干擾測(cè)定，這顯然與NADH氧化酶的誘導(dǎo)有關(guān)。然后對(duì)透化細(xì)胞進(jìn)行PTS測(cè)定。使用BCA測(cè)定法測(cè)量樣品的蛋白質(zhì)濃度，PTS活性以PEP依賴性方式表示為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)氧化的NADH納摩爾數(shù)。
結(jié)果
戈登氏鏈球菌中fruA、levD和manL同源物的鑒定。為了在戈登氏鏈球菌DL1株的基因組中找到同源的外切-β-D-果糖苷酶(fruA)基因，使用變形鏈球菌的fruA蛋白序列(SMU.78;GenBank基因座標(biāo)簽)在http://www.oralgen.lanl.gov對(duì)戈登氏鏈球菌Challis基因組序列進(jìn)行BLAST搜索。鑒定出一個(gè)同源的開放閱讀框(ORF)SGO_0385(Oralgen基因ID)，也注釋為外切-β-D-果糖苷酶。預(yù)測(cè)戈登氏鏈球菌的fruA基因編碼一個(gè)1408個(gè)氨基酸殘基的多肽，與血鏈球菌、變形鏈球菌和唾液鏈球菌的β-果糖苷酶分別具有95%、58%和56%的同一性。BLAST搜索中鑒定出的第二個(gè)最相近的基因產(chǎn)物是蔗糖-6-磷酸水解酶(SGO_1302)。為了驗(yàn)證fruA作為果糖苷酶的功能，通過等位基因交換用非極性紅霉素抗性決定簇(em)構(gòu)建了fruA突變體，并在含有0.05%葡萄糖和0.5%β2,1-連接的果糖同聚物菊粉的TV培養(yǎng)基中測(cè)試其生長(zhǎng)。雖然野生型菌株正常生長(zhǎng)，呈現(xiàn)典型的二次生長(zhǎng)曲線，但fruA突變體在葡萄糖耗盡后停止生長(zhǎng)（圖1）。因此，該現(xiàn)象表明戈登氏鏈球菌的fruA基因編碼功能性果聚糖水解酶。額外的測(cè)試證實(shí)fruA突變體在利用葡萄糖方面沒有缺陷，并且如果菊粉是培養(yǎng)基中唯一的碳水化合物來源則完全不能生長(zhǎng)（數(shù)據(jù)未顯示）。
類似地，使用變形鏈球菌的果糖/甘露糖特異性酶IIA組分(levD,SMU.1961c)的蛋白序列對(duì)戈登氏鏈球菌基因組序列進(jìn)行BLAST搜索。鑒定出一個(gè)ORF，SGO_1893，注釋為PTS系統(tǒng)的果糖（甘露糖）特異性IIA組分，是編碼IIA組分(levD)以及果糖/甘露糖型滲透酶的IIB、IIC和IID結(jié)構(gòu)域（分別由levE、levF和levG編碼）的四基因操縱子中的第一個(gè)基因。預(yù)測(cè)levD基因編碼一個(gè)145個(gè)氨基酸的多肽，與血鏈球菌、變形鏈球菌和乳房鏈球菌的果糖PTS IIA組分分別具有80%、68%和53%的同一性。同時(shí)還鑒定出一個(gè)葡萄糖/甘露糖特異性PTS IIAB組分(SGO_1679)，命名為manL。預(yù)測(cè)戈登氏鏈球菌的manL基因編碼一個(gè)329個(gè)氨基酸殘基的多肽，與肺炎鏈球菌、血鏈球菌、唾液鏈球菌和變形鏈球菌的IIABMan基因分別具有94%、91%、87%和83%的同一性，并且是編碼EIIMan滲透酶的IIC和IID組分的明顯操縱子的一部分。
戈登氏鏈球菌manL和levD突變體的表征。為了評(píng)估m(xù)anL和levD在戈登氏鏈球菌中的功能，使用非極性em盒在DL1株背景下構(gòu)建了等位基因替換突變體。為了確定manL和levD在碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，使用Bioscreen C監(jiān)測(cè)了野生型菌株以及manL和levD突變體在補(bǔ)充了0.2%葡萄糖、果糖、甘露糖或半乳糖的TV培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。與野生型菌株相比，manL突變體在葡萄糖和甘露糖中的生長(zhǎng)速率較慢，在半乳糖中顯著減慢，但在果糖上僅略微減慢（表1），表明ManL可能參與戈登氏鏈球菌對(duì)葡萄糖、甘露糖和半乳糖的攝取。相反，levD突變體在存在果糖或甘露糖的情況下生長(zhǎng)比DL1慢，這表明LevDEFG在這些己糖的轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。當(dāng)在葡萄糖中生長(zhǎng)時(shí)，野生型菌株和levD突變體之間的倍增時(shí)間沒有顯著差異。
為了驗(yàn)證ManL和LevD在糖轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，將DL1以及manL和levD突變體在含有0.5%葡萄糖、果糖、甘露糖或半乳糖的TV中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。在指數(shù)中期收集細(xì)胞，并分別使用葡萄糖、果糖、甘露糖或半乳糖作為底物測(cè)量PTS比活性。與DL1菌株相比，manL突變體對(duì)葡萄糖、甘露糖和半乳糖的PTS活性顯著降低，但對(duì)果糖的活性略有增加。levD突變體對(duì)果糖的PTS活性顯著降低，對(duì)葡萄糖的活性顯著升高，而對(duì)甘露糖和半乳糖的PTS活性變化很?。▓D2）。這些結(jié)果進(jìn)一步支持ManL參與葡萄糖、半乳糖和甘露糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且可能也參與果糖的利用，而LevD似乎主要負(fù)責(zé)果糖的內(nèi)化。
戈登氏鏈球菌fruA和levD基因的CCR。我們研究了fruA和levD的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上如何響應(yīng)不同的碳水化合物進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過將含有fruA或levD啟動(dòng)子的DNA片段融合到整合載體上的無啟動(dòng)子cat基因，并將啟動(dòng)子融合以單拷貝形式建立在戈登氏鏈球菌染色體上的一個(gè)遠(yuǎn)端位點(diǎn)，構(gòu)建了PfruA-cat和PlevD-cat融合體。用基因融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)化DL1菌株，所得菌株在含有0.5%的葡萄糖、果糖、半乳糖或菊粉，或菊粉與葡萄糖、果糖或半乳糖組合的TV培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后進(jìn)行CAT測(cè)定。如表2所示，當(dāng)細(xì)胞在菊粉上生長(zhǎng)時(shí)，fruA和levD啟動(dòng)子的活性最佳，但當(dāng)細(xì)胞在偏好的碳水化合物葡萄糖或果糖上生長(zhǎng)時(shí)較低。在含有菊粉和葡萄糖、半乳糖或果糖組合的細(xì)胞生長(zhǎng)中，這些啟動(dòng)子融合的表達(dá)也受到抑制。因此，與變形鏈球菌中的同源系統(tǒng)相似，fruA和levD的轉(zhuǎn)錄可由果聚糖聚合物誘導(dǎo)，并在存在偏好碳水化合物時(shí)被抑制。值得注意的是，CCR在含有果糖的培養(yǎng)物中最明顯，而變形鏈球菌中fruA的CCR由葡萄糖最有效地引發(fā)。同樣值得注意的是，半乳糖引起fruA表達(dá)的明顯抑制，但半乳糖在變形鏈球菌中基本上是一種非抑制性碳水化合物。
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