2.3.2酶敏感性
如圖2所示,與對照組相比,植物乳桿菌代謝物經(jīng)過胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后抑菌圈直徑顯著下降(P<0.05),抑菌活性分別喪失了6.8%、4.93%。說明植物乳桿菌代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株具有抑菌活性的物質(zhì)中,存在對蛋白酶敏感的抑菌物質(zhì),推測為蛋白或肽類物質(zhì),但蛋白酶處理后其相對抑菌活性仍>90%,說明起主要作用的可能是非蛋白類的其他物質(zhì)。
圖2酶處理對SCB2505代謝物抑菌活性的影響
與對照組相比,SCB2505代謝物經(jīng)過氧化氫酶處理后抑菌圈直徑顯著下降(P<0.05),抑菌活性喪失了6.16%,說明SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株具有抑菌活性的物質(zhì)中,存在過氧化氫,但過氧化氫酶處理后其相對抑菌活性仍>90%,說明其中含有過氧化氫,但該物質(zhì)并非主要抑菌活性物質(zhì)?？梢?蛋白酶、過氧化氫酶均能影響SCB2505代謝物對指示菌的抑菌活性,但處理后相對抑菌活性均大于90%,由于蛋白類和過氧化氫對高溫較為敏感,這可能是代謝物在熱穩(wěn)定性測試中抗菌活性部分喪失的原因。
2.3.3 pH敏感性
如表3所示,與不調(diào)節(jié)pH的代謝物(CK組)相比,將pH值調(diào)整為3.0時代謝物抑菌效果最強(qiáng),且顯著優(yōu)于CK組(P<0.05),而pH值為5.0、7.0、9.0時,代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株均不顯示抑菌能力?？梢?pH對植物乳桿菌SCB2505代謝物的抑菌活性具有顯著影響,且隨著pH降低,抑菌活性上升,說明該菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸在抑菌活性中發(fā)揮重要的作用,但有機(jī)酸和氫離子濃度在抑菌過程中發(fā)揮的作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
表3 pH對植物乳桿菌SCB2505代謝物抑菌活性的影響
注:采用t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)組及對照組抑菌效果的顯著性差異(P<0.05),以*表示;“-”表示沒有出現(xiàn)抑菌圈。
2.3.4乳酸驗(yàn)證試驗(yàn)
由表4可知,植物乳桿菌SCB2505代謝物具有較好的抑菌活性,抑菌圈直徑達(dá)到(18.75±0.11)mm(A)。MRS液體培養(yǎng)基(E)不具有抑菌活性,但用乳酸將MRS調(diào)至與A組相同的pH(B)時,抑菌圈直徑達(dá)到(15.37±0.24)mm,其抑菌活性大大提高,與對照組(A)比較相對抑菌活性為81.97%。但是,與A組(植物乳桿菌SCB2505代謝物組)相同pH的乳酸水溶液(C)不具有抑菌圈,而添加與B組相同乳酸添加量的水溶液(D)抑菌圈直徑達(dá)到(14.73±0.37)mm,與B組不具有顯著性差異(P>0.05)。由此可見,在中酸性環(huán)境下,氫離子濃度(即pH值)并不是影響代謝物抑菌活性的主要原因,其抑菌活性主要是乳酸所起的作用。在相同pH值下,低濃度的乳酸水溶液不具有抑菌活性,而在MRS體系中,由于乳酸與MRS中的緩沖物質(zhì)中和,導(dǎo)致乳酸根離子累積,隨著pH下降,氫離子與乳酸根離子反應(yīng)形成未解離的乳酸,乳酸濃度超過閾值,從而使其產(chǎn)生抑菌活性。據(jù)報道,未解離的乳酸具有親脂性,能過穿過細(xì)胞膜,在細(xì)菌內(nèi)釋放氫離子,降低細(xì)菌內(nèi)pH值,進(jìn)而影響細(xì)菌的生長速度。此外,乳酸還可以通過破壞酶、抑制蛋白質(zhì)合成、中斷營養(yǎng)吸收、破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的亞結(jié)構(gòu)和功能來影響細(xì)胞代謝,破壞細(xì)胞生長。
表4不同情況下乳酸對指示菌抑菌效果對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖
注:A-未處理的代謝物溶液(pH=3.54);B-乳酸處理的MRS;C-乳酸溶液(pH=3.54);D-與B等量乳酸的水溶液(pH=2.32);E-未處理的MRS;采用t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)組與對照組(A)的顯著性差異(P<0.05),以*表示,“-”表示沒有出現(xiàn)抑菌圈。
結(jié)合2.3節(jié)對抑菌物質(zhì)的分析,推測植物乳桿菌代謝物中的乳酸為主要抑菌物質(zhì),過氧化氫、細(xì)菌素則發(fā)揮協(xié)同作用,且其需要在酸性(pH<5.0)的條件下才能發(fā)揮抑菌活性。
2.4 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株生物被膜的影響
生物被膜是由細(xì)菌或真菌分泌的一層能包裹自身群落的外膜,由胞外聚合物組成。其成分復(fù)雜,能夠保護(hù)膜內(nèi)菌體抵御外界環(huán)境變化及一些抗生素的作用,具有很強(qiáng)的耐受性。如圖3所示,當(dāng)代謝物濃度在0.5 MIC時,抑制率為17.29%;濃度在1.0 MIC時,抑制率為68.50%,與0.5 MIC組相比,生物被膜抑制效果明顯上升(P<0.05),代謝物濃度上升到2.0 MIC時,抑制率上升至為74.00%,但與1.0 MIC相比差異不顯著(P>0.05)。說明植物乳桿菌SCB2505代謝物能夠抑制指示菌生物被膜生成,且呈現(xiàn)一定的梯度依賴關(guān)系,但代謝物濃度上升到1.0 MIC后,抑菌效果基本不變。
圖3 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株生物被膜的影響
注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。
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