1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 菌懸液與低濃度微酸性電解水的制備
將副溶血性弧菌劃線到3%氯化鈉TSA平板上獲得單菌落，挑取單菌落于3%氯化鈉TSB肉湯中37攝氏度振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。用0.85%的生理鹽水洗滌并調(diào)整菌懸液濃度至108 CFU/毫升。同時(shí)，通過電解水發(fā)生器電解0.1%氯化鈉和0.01%鹽酸溶液制備后稀釋得到低濃度微酸性電解水，立即測定其有效氯濃度、pH值與氧化還原電位值。
1.3.2 低濃度微酸性電解水對純培養(yǎng)菌懸液的處理
將1毫升菌懸液加入到9毫升不同濃度的低濃度微酸性電解水中，處理30秒后用0.5%硫代硫酸鈉中和劑終止殺菌。然后用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，從適宜梯度中取0.1毫升涂布于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板或鐵瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。無菌去離子水處理作為空白對照。
1.3.3 蝦樣品的接種及低濃度微酸性電解水對接種蝦的處理
參照王等方法，將蝦沸水浴20分鐘，滅活蝦體內(nèi)的原生細(xì)菌。待蝦冷卻到室溫，將1毫升不同菌懸液分別滴加于蝦的背部和腹部，靜置附著20分鐘。接種濃度約為7 lgCFU/克。接種后，將蝦放入180毫升低濃度微酸性電解水中，分別浸泡0.5、1、3、5、10分鐘。處理結(jié)束后，將蝦轉(zhuǎn)移至中和劑中均質(zhì)2分鐘，如1.3.2節(jié)所述進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。未處理的接種蝦作為對照組。
1.3.4 微生物生長曲線
將不同處理后的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌菌懸液按照10%接種量添加于3%氯化鈉TSB和LB肉湯中，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為37攝氏度和25攝氏度，用微生物生長曲線分析儀每隔1小時(shí)測定1次OD600nm值，總運(yùn)行時(shí)長為24小時(shí)。每組3個(gè)平行。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)，繪制微生物生長曲線。
1.3.5 膜電位測定
細(xì)菌膜電位的測定參照Fadhel等方法。在不同處理后的菌懸液中加入1微摩爾/升熒光染料DIBAC4，黑暗中孵育20分鐘，使用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)/發(fā)射波長為492/515納米。
1.3.6 電導(dǎo)率的變化
將不同處理后的菌懸液在12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心3分鐘，收集上清液，然后使用水質(zhì)檢測儀測定其電導(dǎo)率。
1.3.7 細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)滲漏量測定
將不同處理后的菌懸液在12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心3分鐘，收集上清液。使用紫外可見分光光度計(jì)測定OD260nm表示DNA含量。蛋白質(zhì)含量采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定。K+濃度使用火焰原子吸收光譜儀測定766.5納米處的吸光度。
1.3.8 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平測定
活性氧檢測試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。在低濃度微酸性電解水處理前，先將細(xì)菌懸液在12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心3分鐘，將細(xì)胞懸浮于10毫摩爾/升DCFH-DA溶液，37攝氏度孵育20分鐘。再用無菌生理鹽水清洗，去除多余的DCFH-DA。
1.3.9 細(xì)菌內(nèi)ATP含量測定
將不同處理后的菌懸液在12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心3分鐘，棄上清液，加裂解液破碎細(xì)菌，離心取上清液，按照ATP檢測試劑盒說明測定ATP濃度。
1.3.10 掃描電子顯微鏡觀察
將不同處理后的菌懸液于8000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，棄上清液。所得沉淀用2.5%的戊二醛溶液懸浮后固定10小時(shí)，用無菌生理鹽水洗滌3次后，分別用30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脫水后重懸，取適量樣品滴至導(dǎo)電硅片上，二氧化碳臨界點(diǎn)干燥后固定噴金，在掃描電鏡下觀察菌體形態(tài)。
1.3.11 激光共聚焦顯微鏡觀察
將不同處理后的菌懸液于8000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5分鐘，棄上清液后懸浮至無菌生理鹽水中。向每1毫升細(xì)菌懸液中加入3微升SYTO 9/PI的2X染料，在黑暗中孵育15分鐘。滴加5微升在載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光并拍照分析。SYTO 9和PI染料的激發(fā)/發(fā)射波長分別為485/540納米和535/610納米。
1.4 統(tǒng)計(jì)分析
所有實(shí)驗(yàn)均為3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行顯著性分析，差異顯著水平；采用Origin 2022軟件作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 低濃度微酸性電解水對純培養(yǎng)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅效果
不同有效氯濃度的低濃度微酸性電解水的理化性質(zhì)及對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅情況如表1所示。相比于對照組，有效氯濃度為0.5、1、2毫克/升的微酸性電解水處理后，副溶血性弧菌分別減少了1.93、4.03、5.29 lg CFU/毫升，而腐敗希瓦氏菌分別減少了0.59、1.17、2.8 lg CFU/毫升。當(dāng)有效氯濃度為4、8毫克/升時(shí)，副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌相繼被殺滅至未檢出水平，可知低濃度微酸性電解水對副溶血性弧菌的殺菌效果更顯著。并且隨著有效氯濃度增加，兩種菌的細(xì)菌數(shù)量均顯著下降，說明有效氯濃度是影響殺菌效果的主要因素。與先前的報(bào)道結(jié)果一致，有效氯濃度越高，低濃度微酸性電解水對大腸桿菌、沙門氏菌以及銅綠假單胞菌的殺菌活性也越強(qiáng)。
2.2 低濃度微酸性電解水處理對蝦表面接種菌的殺菌效果
低濃度微酸性電解水對接種了副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的海蝦進(jìn)行不同時(shí)間的處理，結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，殺菌效果隨著處理時(shí)間的延長而顯著增強(qiáng)。當(dāng)處理時(shí)間為10分鐘時(shí)，副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的微生物數(shù)量分別下降了1.6、1.25 lg CFU/克。低濃度微酸性電解水殺滅含有機(jī)物質(zhì)的食品基質(zhì)中的微生物時(shí)，低濃度微酸性電解水中的有效作用成分在有機(jī)物質(zhì)作用下會產(chǎn)生損耗，故海蝦表面接種菌與純培養(yǎng)細(xì)菌殺滅效果差異較大。
圖1 低濃度微酸性電解水處理對蝦表面接種的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅效果
注：不同處理中不同大寫或小寫字母表示差異顯著。
2.3 低濃度微酸性電解水處理對細(xì)菌生長的影響
通過測定生長曲線進(jìn)一步評估了低濃度微酸性電解水對2種菌的抑制作用，結(jié)果如圖2所示。在對照組中，副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌都經(jīng)過2小時(shí)遲緩期后迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，隨后在13小時(shí)和14小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期。隨著有效氯濃度的增加，兩種菌的遲緩期都明顯延長，并且最終細(xì)菌濃度都相應(yīng)降低。值得注意的是，在有效氯濃度為10毫克/升時(shí)腐敗希瓦氏菌被完全抑制生長，而有效氯濃度為6毫克/升時(shí)即可徹底殺滅副溶血性弧菌，與平板計(jì)數(shù)結(jié)果一致。李等報(bào)道有效氯濃度為12毫克/升的低濃度微酸性電解水可在30秒內(nèi)完全殺滅單核細(xì)胞增多性李斯特菌，說明不同的細(xì)菌對有效氯濃度敏感性存在一定差異。
A-副溶血性弧菌；B-腐敗希瓦氏菌
圖2 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌生長的影響
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