2.5 HRB2019株的增殖與鑒定
CRFK細(xì)胞在接種HRB2019株后的24 h開始出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、聚集、空斑等的皰疹病毒感染導(dǎo)致的典型細(xì)胞病變，測(cè)得HRB2019株的病毒滴度為1×108.43 TCID50·mL-1。電鏡觀察CRFK細(xì)胞感染HRB2019株的超離后產(chǎn)物，可見明顯的皰疹病毒典型形態(tài)的病毒粒子，成球形、有囊膜、直徑約為200 nm；以FHV-1貓?jiān)搓?yáng)性血清為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗貓IgG為二抗，對(duì)分離病毒株進(jìn)行IFA鑒定，結(jié)果顯示，感染HRB2019株的CRFK出現(xiàn)特異性綠色熒光，對(duì)照組正常CRFK細(xì)胞無(wú)熒光；以MOI為0.01的HRB2019株感染CRFK細(xì)胞，每隔12 h取細(xì)胞上清進(jìn)行病毒含量檢測(cè)，繪制的生長(zhǎng)曲線顯示，病毒接種細(xì)胞后12 h開始復(fù)制，12~36 h快速增殖，48~72 h進(jìn)入增殖平臺(tái)期且滴度達(dá)到高峰，84 h病毒滴度開始下降(圖4)。
A.HRB2019分離株電鏡觀察結(jié)果。B.HRB2019分離株的IFA鑒定結(jié)果(200×):a.感染HRB2019株的CRFK細(xì)胞；b.正常CRFK細(xì)胞。C.HRB2019分離株生長(zhǎng)動(dòng)力曲線
圖4 HRB2019株鑒定結(jié)果
2.6 HRB2019株基因序列分析
將HRB2019株與國(guó)內(nèi)外流行的FHV-1毒株gD基因核酸序列進(jìn)行核苷酸同源性及遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，HRB2019株(▲表示)與GenBank收錄的國(guó)內(nèi)外貓?jiān)碏HV-1流行株核苷酸同源性100%，但與一株虎源的廣東分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(KJ466150)，核苷酸同源性為99.8%，說(shuō)明FHV-1的宿主特異性較高(圖5)。
圖5 HRB2019分離株gD基因系統(tǒng)進(jìn)化樹
3討論
目前，我國(guó)是僅次于美國(guó)的寵物犬、貓飼養(yǎng)大國(guó)，犬、貓數(shù)量位居全球第二。引起貓上呼吸道感染綜合征的主要病原微生物包括FHV-1、FCV、衣原體、支氣管敗血性博代氏桿菌、支原體、呼腸孤病毒等。其中，由FHV-1、FCV引起的病毒性感染占上呼吸道綜合征總發(fā)病率的85%以上，F(xiàn)HV-1和FCV混合感染也十分常見。牛昊巖等對(duì)2018—2019年南京市2 249例寵物貓病例的調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，傳染病占總病例數(shù)的14.32%，最常見的為上呼吸道感染，其中，F(xiàn)HV-1和FCV的混合感染占總數(shù)的8.33%；李麗景在2020—2021年對(duì)西南部分地區(qū)FHV-1和FCV的感染情況進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，183份發(fā)病貓拭子樣本中FHV-1、FCV混合感染率為10.14%。由此可見，F(xiàn)HV-1和FCV的混合感染在貓上呼吸道病中的比例極高，加之寵物醫(yī)院所使用的診斷試劑在準(zhǔn)確性、敏感性等存在不足，常常造成漏診的現(xiàn)象，給貓上呼吸道病的診斷和防治帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。
本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CV與FHV-1相比，存在明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，有FCV存在時(shí)，細(xì)胞病變速度快、病毒滴度高，會(huì)抑制FHV-1在細(xì)胞上的復(fù)制與增殖，且FCV病毒滴度遠(yuǎn)高于FHV-1。研究中筆者嘗試用雞胚尿囊膜途徑接種病毒、siRNA體外干擾、噬斑純化、紅細(xì)胞凝集特性、差異化細(xì)胞培養(yǎng)等方法分離FCV與FHV-1，均以失敗告終。FCV病毒本身具有高變異的特性，抗血清對(duì)非親本毒株不能表現(xiàn)完全中和活性。故本研究先利用FCV的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)分離出FCV，并制備其特異性抗血清，通過(guò)血清中和試驗(yàn)摸索能完全中和FCV且FHV-1能病變的血清中和條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在病毒稀釋倍數(shù)較低的A、B組，F(xiàn)CV抗血清不能完全中和FCV，依然表現(xiàn)為FCV和FHV共存，且FCV具有壓倒性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)而不能分離出FHV-1；而D組在病毒高稀釋倍數(shù)條件下，F(xiàn)CV和FHV-1含量過(guò)低，其中的FCV被其抗血清完全中和，而FHV-1的含量不足以感染足夠數(shù)量的細(xì)胞發(fā)生肉眼可見的病變。最終摸索出最佳血清中和條件為C組，即FCV抗血清與混合毒體積比為8∶1，從而成功中和FCV并分離出FHV-1。在已有的貓呼吸道病原分離鑒定的研究報(bào)道中，部分研究者習(xí)慣于將病料先接種細(xì)胞增殖培養(yǎng)后再進(jìn)行病原鑒定，這很容易造成無(wú)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的病原在培養(yǎng)過(guò)程中丟失。按照本研究的病毒分離方法可以很大程度避免在分離混合感染病料時(shí)對(duì)FHV-1的漏檢，提高了FHV-1的分離率，為了解FHV-1的真實(shí)感染情況提供了理論依據(jù)，為眾多動(dòng)物疫病混合感染的研究提供了技術(shù)支撐。
當(dāng)前國(guó)內(nèi)使用的貓鼻氣管炎、杯狀病毒、泛白細(xì)胞減少癥的三聯(lián)疫苗仍為上世紀(jì)80年代研制的進(jìn)口疫苗，國(guó)產(chǎn)貓疫苗還處于研發(fā)階段，因此對(duì)貓群中主要傳染性病原的分離與研究是重中之重。本文建立的FHV-1、FCV混合感染病毒的分離方法，為FHV-1及FCV的分離提供了新思路，對(duì)加快FHV-1病原學(xué)、疫苗學(xué)、分子生物學(xué)研究的步伐起到重要作用，為我國(guó)貓疫苗的開發(fā)的研究奠定了基礎(chǔ)。
4結(jié)論
本研究利用血清中和試驗(yàn)從FCV、FHV-1混合感染的病貓拭子中分離出1株FHV-1，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、體外培養(yǎng)特性鑒定及gD基因的遺傳進(jìn)化分析，確認(rèn)該毒株為FHV-1，并命名為HRB2019株。
相關(guān)新聞推薦
1、葡萄糖、乳酸鈉對(duì)丙酸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響（二）
2、低pH對(duì)釀酒酵母酒精發(fā)酵的影響及酵母應(yīng)答酸脅迫機(jī)制初探
3、全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀應(yīng)用：黃芩素與殼聚糖抑制酵母生物膜研究（一）