討論
從ORR S-3池塘延伸的污染羽流代表了一個極端的人為污染環(huán)境例子。該站點提供了一個獨特的機會研究高濃度硝酸鹽和多種金屬對微生物群落的影響。例如，使用三維電阻率斷層掃描測量估計ORR站點主要含硝酸鹽羽流中硝酸鹽濃度高達50 g/升，并且從羽流內(nèi)污染井直接化學分析顯示硝酸鹽濃度高達11.6 g/升（190 mM）。相比之下，其他污染環(huán)境中的硝酸鹽濃度約低兩個數(shù)量級。這些包括受農(nóng)業(yè)肥料實踐影響的Chesterville Branch Watershed,MD（10 mg/升），以及伊朗設(shè)拉子市下的Shiraz沖積含水層，高度污染硝酸鹽來自農(nóng)業(yè)和工業(yè)活動，硝酸鹽濃度高達149 mg/升。美國環(huán)境保護署（EPA）對飲用水中硝酸鹽的最大污染水平（MCL）為10 mg/升。
類似地，在混合物金屬污染方面，ORR站點在金屬數(shù)量
同樣地，在金屬混合物污染方面，ORR場地在金屬數(shù)量和濃度方面具有獨特性。例如，對S-3池塘附近受污染井的直接化學分析顯示，許多金屬的濃度升高，包括鋁（560毫克/升）、錳（170毫克/升）、鈾（140毫克/升）、鎳（9.4毫克/升）、鈷（1.8毫克/升）、鎘（1.1毫克/升）、銅（0.95毫克/升）和鐵（0.55毫克/升）（12）。與其他受污染場地的比較較為困難，因為數(shù)據(jù)通常
可用于排放到環(huán)境中的廢水。例如，不銹鋼酸洗產(chǎn)生的冶金廢水含有更高濃度的鐵（133.2毫克/升）和鎳（30.3毫克/升），但這些數(shù)值是在排放到環(huán)境之前（23）。同樣，在酸性礦山排水（AMD）場地，如肯塔基州的派克維爾AMD場地，排放到當?shù)叵髑暗膹U水中鐵的濃度（2.88毫克/升）高于ORR羽流中的濃度，但其他金屬如錳（1.25毫克/升）和鋁（0.641毫克/升）的濃度則低得多（28）。在田納西州的寡婦溪AMD場地，進水中的鐵濃度（474毫克/升）遠高于ORR場地，但錳（9.4毫克/升）、鋁（1.8毫克/升）和鎘（0.04毫克/升）的水平則低得多（29）。華盛頓州的米德內(nèi)特礦山是一個已關(guān)閉的露天鈾礦，水樣中錳（143毫克/升）和鈷（1.6毫克/升）的水平與ORR相似，但鈾（24毫克/升）、鎳（2.7毫克/升）、銅（0.18毫克/升）、鐵（0.18毫克/升）和鎘（0.05毫克/升）的濃度較低（30）。從德國約翰格奧爾根施塔特的鈾廢料堆中采集的沉積物樣本中，鐵（760毫克/升）和銅（6.6毫克/升）的濃度高于ORR，但鋁（680毫克/升）、鎳（5.0毫克/升）和鈷（2.4毫克/升）的濃度相似，錳（50毫克/升）和鈾（3.0毫克/升）的濃度較低。
本研究中鑒定的七種耐金屬菌株均從ORR地下水或沉積物中分離獲得，所用富集物模擬了污染環(huán)境中的金屬濃度。需要強調(diào)的是，不同金屬可劃分為不同類別，且其化學性質(zhì)差異顯著。例如，大多數(shù)金屬以可溶性二價陽離子形式存在于中性酸性pH的地下水中，包括Cu2、Cd2、Fe2、Co2、Ni2和Mn2。相比之下，部分金屬如Al3和Fe3為三價陽離子，在中性pH條件下形成不溶性氫氧化物，且在pH低于5.5和3.0的地下水中大多可溶。進一步對比顯示，鈾以可溶性氧陽離子二氧化鈾2形式存在，而鉻則以可溶性氧陰離子鉻酸鹽2形式存在。表3展示了這七種新菌株對不同金屬的敏感性，其中金屬按化學性質(zhì)分組。在二價陽離子中，所有菌株的EC50值普遍相似，抗性按Cu、Cd、Co、Ni、Mn順序遞增。對于氧陽離子二氧化鈾2，除Castellaniella sp.菌株MT123外，其他菌株均表現(xiàn)出高度抗性，但氧陰離子鉻酸鹽2的EC50值范圍較大。有趣的是，MT123對氧陽離子（二氧化鈾2）和氧陰離子（鉻酸鹽2）高度敏感，但對毒性更強的二價陽離子Cu2和Cd2的耐受性優(yōu)于大多數(shù)其他菌株。進行金屬抗性生長研究時，MT123的最佳生長pH低于其他菌株（pH 5.5對比pH 6.0至7.0）。在復雜有機介質(zhì)中，由于形成不同磷酸鹽、硫酸鹽和氫氧化物離子時的形態(tài)變化，鈾和鉻的毒性會隨pH值大幅波動。
其中五株菌株來源于受污染的地下水，但另外兩株——Pantoea sp.菌株MT058和Serratia sp.菌株MT049——分別從未受污染的沉積物和地下水中分離獲得，這表明硝酸鹽和金屬抗性菌株存在于未受污染的環(huán)境中。有趣的是，其中一株菌株MT058對COMM的抗性排名第二（EC50值為0.7）。MT058的ESV不僅在多個未受污染的水井中發(fā)現(xiàn)，還在四個含有超過5 M鈾的受污染水井中發(fā)現(xiàn)，其中一井含有50 M鈾。
事實上，我們分離出的七株菌株中有四株（MT049、MT058、MT094和MT0123）的ESV在多個ORR水井中被發(fā)現(xiàn)，且所有四株菌株均存在于未受污染的水井和至少一個含有超過15 M鈾的受污染水井中。因此，即使從未受污染的環(huán)境樣本開始，本研究中用于在環(huán)境相關(guān)金屬濃度下富集金屬抗性細菌的方法也取得了成功。金屬抗性菌株生長的pH范圍較廣，這與產(chǎn)生ESV匹配的水井pH值相吻合（圖4A）。例如，MT123的pH最適值為5.5，在pH為5.2的地下水井（FW104）中占ESV匹配的7%。同一菌株（MT123）也在其他水井中以較低水平存在。
pH值范圍在3.4至9.8之間。另一方面，兩種Paenibacillus sp.菌株（MT086和MT124）在ORR地下水調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)任何ESV匹配。由于Paenibacillus屬物種是產(chǎn)孢生物，其DNA可能未在16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)中被檢測到。此外，這兩種菌株是從FW126井中分離的，該井的pH值（3.0）為所有ORR污染井中最低之一，且硝酸鹽和金屬濃度最高（表1）。盡管先前在ORR污染沉積物中已通過16S rRNA基因序列檢測到多種Paenibacillus屬物種（34），但此類條件可能促進孢子形成和/或使地下水樣本的DNA提取復雜化。
未來在ORR進行的地下水16S rRNA調(diào)查可受益于使用內(nèi)部孢子對照來確定從高度可變的地下水基質(zhì)中提取DNA的效率。本研究的獨特之處在于，它研究了ORR中的硝酸鹽還原與多金屬抗性相結(jié)合，而非僅關(guān)注單一種或少量金屬的硝酸鹽還原或抗性。一項綜述研究了ORR中硝酸鹽還原菌，并結(jié)合了24項不同研究的微生物群落數(shù)據(jù)。該綜述確定了32個潛在的硝酸鹽還原屬，這些屬與本研究的分離株有顯著重疊。
事實上，在研究中通過逆轉(zhuǎn)錄總RNA擴增來特異性觀察ORR（25,35,36）處的活性微生物群落時，鑒定出了硝酸鹽還原菌卡斯特拉尼埃拉和潘尼芽孢桿菌。在對硝酸鹽污染井進行乙醇生物刺激實驗時，還鑒定出一種卡斯特拉尼埃拉菌，這可能對ORR（37）處的原位硝酸鹽去除具有重要意義。從ORR處污染沉積物中分離出的幾種芽孢桿菌和其他物種隨后被篩選出對鉛、汞、鉻、鎘和鈾的抗性。然而，本研究與當前研究的不同之處在于，這些菌株未在硝酸鹽還原條件下進行表征，且富集過程未在反映污染環(huán)境的金屬濃度下進行。
在我們的研究中，從ORR環(huán)境中分離出七種新的菌株，這些菌株能夠在多種金屬（包括鋁、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鎘和鈾）存在的情況下，通過還原硝酸鹽獲取生長所需的能量，這些金屬的濃度接近于ORR污染現(xiàn)場的水平。事實上，當這七株分離菌在有或沒有COMM金屬混合物的條件下培養(yǎng)時，其硝酸鹽還原速率相似（圖3）。已知高濃度的多種金屬離子會破壞氧化還原酶類酶（如硝酸鹽還原酶）和呼吸途徑（如反硝化作用）。例如，在一項關(guān)于鹽沼沉積物中反硝化速率的研究中，報告指出初始反硝化速率受到幾種金屬（包括鉛、鎳、鉻、鋅、銅、鐵和鎘）在1克/升濃度下的抑制（24）。同樣地，對模型反硝化生物——假單胞菌RCH2在反硝化條件下進行的全基因組適應性測定顯示，當在高濃度的幾種不同金屬（包括銅、鋅、鉻和鈾）存在時，硝酸鹽還原酶和反硝化相關(guān)基因的破壞會導致該生物在高濃度金屬存在下的適應性下降（39,40）。因此，我們分離出的ORR生物體必定具有分子和物理層面的金屬抗性機制，使它們能夠在極端的ORR環(huán)境中生存，而這些機制的性質(zhì)目前仍在研究中。
總體而言，S-3池塘周圍受硝酸鹽和金屬污染的ORR站點是一個極端環(huán)境，我們從中分離出七種新的硝酸鹽還原細菌，這些菌株能夠單獨且同時耐受多種金屬的組合，包括二價陽離子、三價陽離子、氧陽離子和氧陰離子。這些菌株在pH最適值、生長pH范圍、碳源偏好和金屬耐受程度方面表現(xiàn)出多樣性。其中幾種菌株還通過16S rRNA基因序列在多種ORR未污染和污染井中被檢測到。然而，所有菌株在環(huán)境相關(guān)濃度的多種金屬存在下生長時，均保持硝酸鹽還原酶活性。未來對這些菌株所含金屬耐受分子機制的研究可能揭示獨特性質(zhì)，進一步增進我們對其他硝酸鹽和金屬污染站點中微生物群落的理解。
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