2.3根瘤菌噬菌體的一步生長曲線
根瘤菌噬菌體感染宿主后的一步生長曲線如圖2所示。SMM-1、SMM-2、SMM-3感染宿主菌的潛伏期分別是2、4和2h,爆發(fā)期持續(xù)12、10和10h,裂解量分別是362、472和1339 PFU·mL-1;SSS-1、SSS-2、SSS-3的潛伏期分別為8、8和6h,噬菌體量均在22h時達到最大，其爆發(fā)期持續(xù)時間分別為14、14和16h,裂解量分別為500、351和305 PFU·mL-1;BDM-1、BDM-2、BDM-3的潛伏期較長，分別為18、18和12h,3株噬菌體均在54h后才完成裂解，其爆發(fā)期持續(xù)36、36和42h,裂解量分別為18、65和278 PFU·mL-1.對比發(fā)現(xiàn)，BDM的潛伏期和爆發(fā)期明顯大于SMM和SSS,獲得的裂解量最小。表明相同宿主的根瘤菌噬菌體的潛伏期和爆發(fā)期存在一定差異，但不明顯，而不同宿主間根瘤菌噬菌體的潛伏期和爆發(fā)期差異較大。
2.4根瘤菌噬菌體生物學(xué)特性
圖3分別為不同宿主根瘤菌噬菌體對溫度、pH和紫外光的敏感性?？梢钥闯?，SMM、SSS和BDM噬菌體株均在30——40℃之間活性較好，當(dāng)溫度高于40℃時，根瘤菌噬菌體的裂解活性出現(xiàn)不同程度的下降。當(dāng)溫度達到60℃時9株噬菌體的裂解量均降低了90%以上。當(dāng)溫度高于70℃時，SMM和BDM噬菌體活性均基本喪失，而SSS在溫度達到80℃時才完全失活。與SMM和BDM相比，SSS對溫度有較高的耐受性。
SMM在pH為7.0——8.0之間時，滴度達到最大值，pH>8.0時效價下降較快，當(dāng)pH達到12時，噬菌體雖仍有活性，但與最適pH相比，效價降低了90%以上。SSS在酸性條件下，隨pH升高，其滴度值不斷增加，在pH為6.0——9.0的范圍內(nèi)，其效價值變化不大，且達到最大值，說明SSS對pH的適應(yīng)性較好，
在酸性及弱堿條件下均具有較強的侵染能力。而BDM在pH=7的中性條件下滴度值達到最大，當(dāng)pH<7.0時，隨著pH升高，噬菌體滴度呈增加趨勢，當(dāng)pH>7.0時，其滴度值迅速下降，說明BDM不適合在堿性環(huán)境中生存。
不同宿主噬菌體的存活率隨紫外光照射時間延長呈明顯下降趨勢。當(dāng)照射3min時，SMM、SSS和BDM分別降低了50.3%、86.2%和45.4%;照射9 min時，9株噬菌體存活率極低但仍有活性；當(dāng)照射12min后，所有噬菌體株完全喪失侵染能力。表明宿主噬菌體對紫外光均較敏感，與SMM和BDM相比，SSS對紫外光更為敏感。
3討論
噬菌體是通過侵染細菌并使菌體發(fā)生裂解而完成增殖的一類病毒（virus）。噬菌體具有調(diào)節(jié)細菌群落組成、數(shù)量和代謝等功能，在調(diào)控全球生物地球化學(xué)循環(huán)及維持生態(tài)功能等方面發(fā)揮著重要的作用。Demolon等于1935年首次在土壤中分離獲得了紫花苜蓿（Medicago sativa）根瘤菌噬菌體，研究證實噬菌體的侵染在一定程度上降低了土壤中苜蓿根瘤菌的數(shù)量，并間接導(dǎo)致了產(chǎn)量的顯著下降。Wer-quin等對33株苜蓿根瘤菌的侵染試驗證明，噬菌體可以通過定向選擇消除特定類型的苜蓿根瘤菌，進而誘使苜蓿根瘤菌種群的數(shù)量和演化進程發(fā)生改變。此外，Hashem等對慢生大豆根瘤菌（Bra-dyrhizobium japonicum USDA 117）噬菌體的研究結(jié)果證明，大豆根瘤菌噬菌體的侵染導(dǎo)致無效根瘤菌的大量產(chǎn)生，進而直接或間接導(dǎo)致豆科作物固氮效率和產(chǎn)量的顯著下降。
以不同種基因型根瘤菌為宿主，本研究共分離獲得9株噬菌體，電鏡觀察SMM和BDM具有相同的形態(tài)特征，均屬于肌尾噬菌體科。對比SMM和BDM外部形態(tài)發(fā)現(xiàn)，其頭部大小相似，但尾部長短存在明顯差異，BDM尾部比SMM噬菌體長38——43 nm.而中華根瘤菌SSS噬菌體株屬于長尾噬菌體科。此外，與已報道的噬菌體形態(tài)對比發(fā)現(xiàn)，SMM和BDM分別與豌豆噬菌體RES和RL2、三葉草噬菌體CT6的外部形態(tài)一致，但頭部和尾部尺寸存在一定差異，而BDM噬菌體與鷹嘴豆（Cicerarieti-num）根瘤菌噬菌體RC1形態(tài)相似。
本研究對9株根瘤菌噬菌體的一步生長曲線和最佳感染復(fù)數(shù)的分析結(jié)果顯示，相同宿主噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)、潛伏期和爆發(fā)期雖存在一定差異，但分異度遠小于不同宿主根瘤菌噬菌體的變化。此外，與已有的研究結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，SMM的潛伏期2——4h,與Atkins和Werquin等報道的苜蓿根瘤菌噬菌體潛伏期時間相一致。SSS的潛伏期為6——8h,略短于已報道的豇豆（Vignaunguiculata）噬菌體JRW3（潛伏期12h），但兩者間14——16h的爆發(fā)期持續(xù)時間相同。而獲得的慢生根瘤菌噬菌體BDM的潛伏期為12——18h,爆發(fā)期為36——42h,顯著高于目前已報道的豌豆根瘤菌噬菌體。Singh等對兩株豇豆噬菌體的生物學(xué)特性進行對比分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體RS1的潛伏期顯著低于RS2,而產(chǎn)生析發(fā)現(xiàn)，噬菌體RS1的潛伏期顯著低于RS2,而產(chǎn)生這種差異的原因可能是由于RS2宿主菌的生長時間高于RS1,并推測豆科作物根瘤菌噬菌體的潛伏期時間與宿主的生殖時間存在相關(guān)關(guān)系。
有研究證明，溫度、pH和紫外光照射是噬菌體生存和穩(wěn)定性的主要影響因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同宿主的噬菌體株在30——40℃的范圍內(nèi)均可穩(wěn)定存活，同時具有較強的侵染能力。當(dāng)溫度達到60℃時，所有噬菌體的滴度值均顯著下降90%以60℃時，所有噬菌體的滴度值均顯著下降90%以上。這與Ji等對噬菌體VMY22的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果一致，VMY22噬菌體在20——40℃時穩(wěn)定性較高，而溫度超過60℃時其存活率和侵染能力均顯著降低。此外，Ahmad等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度達到60℃時，豇豆根瘤菌噬菌體JRW3的存活率降低了95%以上，說明噬菌體的存活率和侵染能力對溫度較為敏感，但不同豆科根瘤菌噬菌體間存在一定的差異。
噬菌體的活性受pH影響較大，如SMM在pH為7.0——8.0之間時，滴度達到最大值，當(dāng)pH>8.0時效價迅速下降。BDM在pH=7的中性條件下滴度達到最大值，當(dāng)pH>7.0，其滴度值迅速降低。而SSS在酸性條件下，隨pH升高，其滴度值不斷增加，在pH為6.0——9.0的范圍內(nèi)，其侵染活性最高，說明SSS對pH的適應(yīng)性較好，在酸性及弱堿條件下均具有較強的侵染能力。該研究結(jié)果與Appunu等報道相一致，根瘤菌噬菌體在中性條件下存活率和侵染能力最強。
紫外光照射是影響噬菌體活性的另一主要因素，在連續(xù)照射3min時，噬菌體活性均存在顯著下降的趨勢，然而不同宿主的噬菌體存在一定差異。對比發(fā)現(xiàn)，中華根瘤菌噬菌體SSS對紫外光更為敏感，照射3min其活性降低了86%左右。
綜上所述，侵染相同宿主噬菌體在外部形態(tài)、MOI、一步生長曲線特征及對溫度、pH及紫外光穩(wěn)定性均存在一定差異，但在程度上均沒有不同宿主噬菌體間差異顯著。該研究結(jié)果與Werquin等對33株根瘤菌噬菌體間的生物學(xué)特征對比結(jié)果一致，具有外部形態(tài)相似根瘤菌噬菌體間在噬菌體滴度、菌斑大小和噬菌體敏感性方面存在微小的差異，不同根瘤菌噬菌體可以按照宿主范圍進行分組。本研究結(jié)果為闡明噬菌體、根瘤菌和豆科作物三者間的相互關(guān)系提供了理論數(shù)據(jù)，為根瘤菌噬菌體生態(tài)學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
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