研究簡介
這項研究聚焦于一種新型宿主靶向廣譜抗感染小分子化合物C6，該化合物屬于2-氰基-3-丙烯酰胺類DUB（去泛素化酶）抑制劑。面對全球抗生素耐藥危機和抗病毒藥物選擇有限的嚴峻挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)“病原體直接殺傷”策略逐漸失效，迫使科學界轉(zhuǎn)向“宿主導向療法”。該策略通過調(diào)控宿主自身關(guān)鍵生理過程以增強免疫清除能力，而非直接作用于病原體，從而有望突破耐藥性瓶頸。本研究以泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）為切入點，首次系統(tǒng)性驗證了DUB抑制劑在抗細胞內(nèi)病原體感染中的潛力。研究以兩種細胞內(nèi)病原體——鼠諾如病毒（MNV-1）和單核細胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）為模型，前者為RNA病毒，后者為革蘭氏陽性菌，二者均能在巨噬細胞內(nèi)復制并逃避免疫清除。從39種結(jié)構(gòu)優(yōu)化的DUB抑制劑中篩選出化合物C6，其基于先導化合物WP1130和G9的核心骨架改造而成，關(guān)鍵創(chuàng)新在于通過鹵素取代和側(cè)鏈修飾顯著降低細胞毒性（RAW 264.7巨噬細胞存活率>80%），同時保留甚至增強抗感染活性。實驗表明C6在5μM濃度下預處理巨噬細胞30分鐘，可使MNV-1病毒載量下降超過2個數(shù)量級（8小時），并使李斯特菌胞內(nèi)增殖減少71.7%（28.3%殘留），效果與G9相當?shù)拘愿?。機制上C6通過抑制宿主DUB活性（如USP9x），導致泛素化蛋白積累，干擾病原體利用宿主泛素系統(tǒng)的策略。病毒入侵實驗證實C6不影響MNV-1內(nèi)化，但阻斷其復制后期階段。而對李斯特菌，C6既減緩細菌內(nèi)化（內(nèi)化率從0.89降至0.35），又持續(xù)抑制胞內(nèi)增殖。
值得注意的是，C6對細菌的直接生長無顯著抑制（僅輕微延遲），表明其抗感染作用主要通過宿主調(diào)控實現(xiàn)。藥代動力學研究顯示，C6在小鼠肝微粒體中的代謝半衰期為20分鐘（短于G9的42分鐘），但靜脈注射后半衰期達4小時，血藥濃度顯著高于G9（7小時后54.9 ng/mL vs 4.9 ng/mL），提示其更適合靜脈給藥。這些特性使C6成為首個兼具高效抗感染活性和優(yōu)良藥物特性的DUB抑制劑候選物。本研究突破了傳統(tǒng)抗感染藥物開發(fā)的框架，首次證實通過化學干預宿主DUB可協(xié)同對抗病毒和細菌，為應對耐藥病原體提供了“一石二鳥”的解決方案。未來研究將聚焦C6的特定靶點DUB鑒定、動物模型療效驗證及結(jié)構(gòu)進一步優(yōu)化，推動其向臨床轉(zhuǎn)化。這項成果不僅為泛素系統(tǒng)在感染免疫中的功能研究提供了工具，更為開發(fā)廣譜、低耐藥風險的抗感染藥物開辟了新路徑。
Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀的應用
評估測試化合物對野生型單核細胞增生李斯特菌菌株104035生長的毒性，將細菌培養(yǎng)至600 nm光密度(OD600)為0.5，并在含有無DUB抑制劑(未處理)或終濃度為2.5和5.0μM的化合物C6的BHI肉湯中按1:10稀釋，并在含有DMSO(載體對照)的培養(yǎng)基中稀釋，DMSO體積與所測試化合物體積相匹配。然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到100孔蜂窩板（2板），每孔300μl，一式三份，在Bioscreen C生長曲線分析儀中生長。平板在37℃下以中等速度連續(xù)振蕩孵育18小時，并使用Prism6軟件在線性刻度上繪圖。
實驗結(jié)果
化合物C6是一種新型的2-氰基-3-丙烯酰胺類去泛素化酶（DUB）抑制劑，具有顯著的抗感染活性，能夠有效抑制兩種細胞內(nèi)病原體——鼠諾如病毒（MNV-1）和單核細胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）的復制。C6在細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出低毒性，對RAW 264.7巨噬細胞的存活率影響較小，優(yōu)于先前的先導化合物G9。C6通過抑制宿主細胞內(nèi)的DUB活性，增強宿主細胞的抗感染能力，而不是直接作用于病原體。C6通過抑制DUB活性，導致宿主細胞內(nèi)泛素化蛋白的積累，從而干擾病原體的生命周期。C6在小鼠肝微粒體中的代謝半衰期約為20分鐘，靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時，顯示出良好的藥代動力學特性。C6的血藥濃度在靜脈注射后維持較高水平，優(yōu)于先導化合物G9，表明其具有更好的藥物潛力。
圖1、39種小分子DUB抑制劑中的兩種降低了MNV-1和單核細胞增生李斯特菌在RAW 264.7細胞中的細胞內(nèi)生長，效果與母體化合物G9相似。(A)用于體外感染測試39種小分子化合物對MNV-1(MNV)(左)和單核細胞增生李斯特菌(右)抗感染作用的總體方案。(B和C)使用5μM化合物C6(左)和E3(右)對RAW細胞進行MNV-1。(B)和單核細胞增生李斯特菌(C)細胞培養(yǎng)感染的結(jié)果。還包括使用先前表征的化合物G9的結(jié)果。與載體(DMSO)處理的細胞水平相比，用化合物C6和E3處理導致病毒復制降低超過2個數(shù)量級，細菌生長減少超過50%(載體處理細胞的結(jié)果與未處理細胞無顯著差異；未顯示)。使用單因素方差分析(ANOVA)和Dunnett事后檢驗比較載體處理組和化合物處理組。
圖2、化合物C6在人類細胞中抑制DUB活性并增加鼠細胞中的全局泛素化。(A)HA印跡顯示W(wǎng)P1130和化合物C6在5μM和10μM濃度下的DUB抑制作用。箭頭指示DUB活性抑制區(qū)域。(B)在鼠RAW 264.7細胞全細胞裂解物中使用抗泛素抗體(多聚和單泛素)進行的Western blot，采用30分鐘5μM預處理(左)或30分鐘2.5μM然后1.0μM(右)處理指定時間。印跡圖代表三個獨立實驗，結(jié)果相似。
圖3、單核細胞增生李斯特菌在化合物C6存在下的生長曲線。化合物C6對BHI肉湯培養(yǎng)物中單核細胞增生李斯特菌104035的體外生長產(chǎn)生劑量依賴性效應。該圖繪制了兩次獨立實驗中每種條件的三個重復樣本的平均值，誤差棒代表標準差。
圖4、化合物C6在多種處理條件下對RAW 264.7細胞活力的影響?；衔顲6的濃度和暴露時間導致不同水平的細胞活力。(A)測試C6對RAW細胞活力影響的三種不同策略。策略1，持續(xù)暴露；策略2，僅預處理；策略3，變化暴露(較高預處理濃度和持續(xù)較低濃度，模擬感染方案)。虛線代表RAW細胞暴露于C6的時間。(B到E)RAW 264.7細胞的刃天青細胞活力測定。上面板顯示根據(jù)策略1在8小時(B)和24小時(C)孵育后的細胞活力。下面板顯示根據(jù)策略2和3在8小時(D)和24小時(E)后的細胞活力。結(jié)果以未處理細胞在570 nm處的吸光度百分比(活力百分比)顯示。所示濃度為微摩爾。VC，載體對照。載體對照實驗使用與C6處理組最高濃度體積相匹配的DMSO體積。
圖5、C57BL/6小鼠肝臟微粒體中化合物C6的代謝穩(wěn)定性和短期藥代動力學研究。(A)化合物C6在小鼠肝臟微粒體中的LC-MS/MS分析。代謝半衰期為20.12分鐘。(B)口服和靜脈注射化合物C6的短期藥代動力學分析(每種情況2只小鼠)。在給藥后0.5、2、4和7小時測量血液中的濃度。口服劑量為30毫克/千克，靜脈注射劑量為10毫克/千克。
總結(jié)
抗生素耐藥性的上升和有效抗病毒藥物數(shù)量的稀少，迫切需要治療傳染病的新方法。識別基于宿主的治療靶點代表了藥物發(fā)現(xiàn)的新興策略。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細胞信號傳導的核心模式，可能是增強宿主控制感染能力的治療的有前景靶點。去泛素化酶(DUB)是宿主炎癥反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，之前的研究已證明一種選擇性DUB抑制劑及其衍生物在宿主細胞中促進抗感染活性。
為了尋找具有抗感染功效但改善毒性特征的化合物，本研究測試了一個主要由2-氰基-3-丙烯酰胺小分子DUB抑制劑組成的化合物庫在巨噬細胞中對兩種細胞內(nèi)病原體。鼠諾如病毒(MNV)和單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的抗感染活性。鑒定出化合物C6，它抑制人和鼠細胞中的DUB活性，并在細胞培養(yǎng)中毒性最小的情況下減少兩種病原體的細胞內(nèi)復制。用C6處理并未顯著影響巨噬細胞內(nèi)化病毒的能力，這表明抗感染活性干擾了MNV生命周期中進入后的階段。
代謝穩(wěn)定性和藥代動力學測定顯示，C6在小鼠肝微粒體中的半衰期約為20分鐘，當靜脈注射給藥時在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時。本研究結(jié)果為在開發(fā)針對傳染病的基于宿主的療法中靶向宿主泛素系統(tǒng)提供了框架?；衔顲6代表了一種有前景的工具，可用于闡明DUB在巨噬細胞應對感染反應中的作用。C6的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新型宿主導向療法（HDT）提供了有力的候選化合物，這種療法通過增強宿主的免疫反應來對抗多種病原體，而不是直接靶向病原體，從而降低了耐藥性發(fā)展的風險。
Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀主要用于評估化合物C6對單核細胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）的直接抗菌活性，Bioscreen C的測試的生長曲線為研究團隊提供了關(guān)鍵證據(jù)，證明C6的抗感染活性主要依賴于宿主細胞的調(diào)控機制，而非直接作用于病原體。這支持了宿主導向療法（HDT）的合理性，即通過增強宿主的免疫反應來對抗多種病原體。未來的研究將集中在進一步探索C6的具體作用機制，包括鑒定其抑制的特定DUB酶及其下游靶點，以及在動物模型中驗證C6的抗感染效果和安全性。C6作為一種新型DUB抑制劑，不僅在體外顯示出良好的抗感染活性和低毒性，還具有優(yōu)化的藥代動力學特性，為開發(fā)新型抗感染藥物提供了重要的基礎。
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