研究簡(jiǎn)介
胰腺癌（PC）是全球第三大致死癌癥，其五年生存率僅為9%至11%。盡管手術(shù)切除是目前最有效的治療手段，但化療藥物如5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他濱（gemcitabine）在一定程度上可以改善患者的生存率。胰管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤（IPMNs）是胰腺囊性腫瘤，也是胰腺癌的重要前體病變。越來(lái)越多的證據(jù)表明，IPMNs中可能存在獨(dú)特的腫瘤微生物組，但這些微生物的持久性及其對(duì)癌癥治療的潛在影響尚不清楚。本研究分析了來(lái)自臨床IPMN樣本的細(xì)菌分離株，并通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)和全基因組測(cè)序（WGS）研究了它們與化療藥物的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)分離株能夠降低5-FU和吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞系（PANC-1、AsPC-1和Capan-2）的細(xì)胞毒性。WGS分析顯示，與芽孢桿菌（Bacilli）相比，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）菌株在抗生素抗性、藥物運(yùn)輸和毒力相關(guān)基因上更為豐富。進(jìn)一步的通路分析表明，γ-變形菌綱在嘧啶代謝通路中更為豐富，而芽孢桿菌則在嘌呤代謝通路中更為豐富。這些發(fā)現(xiàn)表明，IPMN相關(guān)細(xì)菌具有代謝活性，能夠調(diào)節(jié)化療藥物的療效。研究發(fā)現(xiàn)IPMN相關(guān)細(xì)菌能夠耐受兩種常用的化療藥物5-FU和吉西他濱，并可能削弱它們對(duì)胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。通過(guò)全基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，研究揭示了可能使這些細(xì)菌能夠在腫瘤微環(huán)境中持續(xù)存在并代謝化療藥物的潛在適應(yīng)機(jī)制。這些細(xì)菌的適應(yīng)機(jī)制可能支持它們?cè)谀[瘤病變內(nèi)的生存，并使它們能夠與嘧啶類似物相互作用。這強(qiáng)調(diào)了闡明腫瘤相關(guān)微生物在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和治療中的功能角色的重要性。
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀用于監(jiān)測(cè)IPMN衍生細(xì)菌菌株的生長(zhǎng)情況。從胰腺I(mǎi)PMN樣本中分離得到的細(xì)菌菌株，經(jīng)過(guò)純化后在血平板上培養(yǎng)，挑選出單個(gè)菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將純化的細(xì)菌菌落接種于5 mL液體腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基中，在37℃、200 rpm的條件下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)一步稀釋至OD為0.1的濃度，用于后續(xù)的生長(zhǎng)曲線測(cè)定。取10μL稀釋后的菌液（OD為0.1）與190μL BHI培養(yǎng)基混合，加入到Bioscreen C系統(tǒng)的100孔蜂窩板中，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。將蜂窩板放入Bioscreen C儀器中，在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。儀器每隔15分鐘自動(dòng)測(cè)量一次菌液在600 nm處的吸光度（OD），以監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。根據(jù)吸光度（OD）隨時(shí)間的變化，繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。通過(guò)生長(zhǎng)曲線可以確定細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期，并計(jì)算出每個(gè)菌株的倍增時(shí)間（DT）。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
胰腺腫瘤相關(guān)細(xì)菌對(duì)化療藥物的耐受性和代謝能力，揭示了這些細(xì)菌如何適應(yīng)腫瘤微環(huán)境并影響化療效果。研究發(fā)現(xiàn)，IPMN（胰管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤）衍生的細(xì)菌對(duì)5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他濱表現(xiàn)出不同程度的耐受性，其中多數(shù)菌株對(duì)吉西他濱敏感，但對(duì)5-FU頻繁耐藥。這些細(xì)菌還能代謝這兩種化療藥物，減弱其對(duì)胰腺癌細(xì)胞的毒性，表明它們具有影響化療效果的內(nèi)在能力。通過(guò)全基因組測(cè)序（WGS）分析，研究發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）菌株比芽孢桿菌（Bacilli）菌株在功能上更豐富，尤其在能量代謝、膜運(yùn)輸?shù)韧緩街小PMN衍生細(xì)菌在嘧啶代謝途徑中基因富集顯著，可能幫助它們?cè)谀[瘤微環(huán)境中生存。研究還發(fā)現(xiàn)，不同惡性程度的IPMN衍生細(xì)菌菌株間存在大量共同基因，這些基因在嘧啶代謝、小分子代謝過(guò)程、DNA修復(fù)等途徑中功能富集，表明這些細(xì)菌通過(guò)這些途徑適應(yīng)了IPMN環(huán)境。這些細(xì)菌的適應(yīng)機(jī)制和代謝能力可能削弱化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和化療耐藥性發(fā)展。
圖1、IPMN衍生菌株對(duì)5-氟尿嘧啶（5-FU）和吉西他濱的敏感性表征。A）IPMN衍生細(xì)菌菌株的分類、分離來(lái)源以及倍增時(shí)間（DT），以及對(duì)照菌株大腸桿菌（E.coli）d12和E.coli 25922。B）IPMN衍生細(xì)菌菌株和對(duì)照菌株的生長(zhǎng)曲線。x軸表示時(shí)間（分鐘），y軸表示在600 nm處的吸光度（OD）（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）。C）確定選定IPMN衍生菌株的半數(shù)抑制濃度（IC50）值的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖，以E.coli d12、E.coli 25922和福賽坦菌（F.nucleatum）菌株作為對(duì)照。D）代表性劑量反應(yīng)曲線，用于計(jì)算IPMN衍生的K.oxytoca（H1）在腦心浸液（BHI）培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)后的IC50值。數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)歸一化、對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，并使用Gompertz方程擬合。E）熱圖顯示了個(gè)別細(xì)菌菌株對(duì)5-FU和吉西他濱兩倍稀釋濃度的反應(yīng)活性?；钚砸韵鄬?duì)于未處理對(duì)照組（設(shè)定為100%）的存活率百分比表示（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3）。左側(cè)為5-FU，右側(cè)為吉西他濱。
圖2、IPMN衍生菌株代謝5-FU和吉西他濱，改變胰腺癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。A）細(xì)菌降解化療藥物的實(shí)驗(yàn)設(shè)置示意圖。5-FU和吉西他濱與個(gè)別細(xì)菌菌株一起孵育4小時(shí)。孵育后，通過(guò)0.2μm濾膜過(guò)濾上清液。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估藥物活性，并測(cè)試了4μM和40μM的指定藥物濃度。以未處理的藥物作為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)藥物活性。B-C：在與IPMN衍生菌株、E.coli和F.nucleatum共同孵育4小時(shí)后，PANC-1和AsPC-1細(xì)胞的存活率定量分析?；熕幬?-FU和吉西他濱（40μM）首先與IPMN衍生菌株一起孵育4小時(shí)，過(guò)濾、稀釋后加入癌細(xì)胞培養(yǎng)中。細(xì)胞存活率在CCK-8實(shí)驗(yàn)中測(cè)量，并在48小時(shí)后以相對(duì)于未處理細(xì)胞的百分比存活率表示。D）熱圖總結(jié)了PANC-1、AsPC-1和Capan-2細(xì)胞系相對(duì)于活性藥物處理的細(xì)胞存活率百分比增加情況。
相關(guān)新聞推薦
1、測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線最常用的方法，細(xì)胞計(jì)數(shù)法怎么鋪板如何換算
2、核心微生物群落中稀有物種重要性、持久性的生態(tài)驅(qū)動(dòng)因素（一）
3、科學(xué)家只用一個(gè)卵細(xì)胞就培育出健康小鼠，都不需要精子了！
4、豬乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、IFA、PCR、免疫印跡試驗(yàn)鑒定（二）