1.2.7噬菌體紫外線敏感性測(cè)定
取噬菌體原液2 mL于直徑9 cm無菌培養(yǎng)皿中，置于超凈工作臺(tái)紫外燈下30 cm照射，間隔5 min取樣，采用雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。
1.2.8噬菌體裂解譜測(cè)定
測(cè)定菌株包括13株枯草芽孢桿菌、5株莫哈韋芽孢桿菌、1株蠟樣芽孢桿菌及1株地衣芽孢桿菌，為實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種庫保存。復(fù)蘇菌株后挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)4 h至對(duì)數(shù)期，取100μL對(duì)數(shù)期菌液與50℃LB半固體培養(yǎng)基混合制備雙層板，上層凝固后在雙層平板中央滴加10μL噬菌體(108 PFU/mL)懸液。37℃溫箱培養(yǎng)6 h觀察是否出現(xiàn)噬菌斑。
1.2.9噬菌體體外裂解試驗(yàn)
將噬菌體富集液10倍比稀釋，濃度依次為108 PFU/mL、107 PFU/mL、106 PFU/mL、105 PFU/mL、104 PFU/mL。分別取不同濃度的噬菌體稀釋液100μL加入96孔板，再向每孔中加入100μL濃度為107 CFU/mL的宿主菌液，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，以200μL菌液作為陽性對(duì)照，以200μL LB液作為陰性對(duì)照。使用動(dòng)態(tài)酶標(biāo)儀，測(cè)定其OD600值，每隔1 h測(cè)定一次，共測(cè)定24 h。
1.2.10抗性菌株篩選
挑取噬菌體裂解的菌株單菌落LB液體培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后按最佳MOI比例加入噬菌體，37℃180 r/min培養(yǎng)至澄清后，取1 mL裂解液轉(zhuǎn)接至對(duì)數(shù)期宿主菌菌液中共培養(yǎng)，如此重復(fù)多次直至培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁后，使用接種棒涂布于LB固體平板，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落使用點(diǎn)斑法進(jìn)行裂解試驗(yàn)，直到篩選出噬菌體不能裂解且穩(wěn)定的抗性菌株。
1.2.11抗性菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)
將抗性菌株與原始菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)6 h作為種子液。將其接種至96孔板，100μL菌液與100μL LB液體培養(yǎng)基，使用酶標(biāo)儀于37℃培養(yǎng)并測(cè)定OD600，每隔1 h測(cè)定一次，測(cè)定48次，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
1.2.12抗性菌株發(fā)酵效價(jià)測(cè)定
同1.2.11培養(yǎng)種子液，按2%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌發(fā)酵，每隔12 h取樣測(cè)定效價(jià)，測(cè)定4次。效價(jià)測(cè)定采用稀釋涂布法，使用LB液進(jìn)行梯度稀釋，吸取菌液100μL涂布LB固體平板，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37℃倒置培養(yǎng)12 h后計(jì)數(shù)菌落形成單位(CFU/mL)。
1.2.13淀粉酶活性測(cè)定
采用DNS法測(cè)定α-淀粉酶活力，使用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株發(fā)酵，測(cè)定8 h、12 h、24 h、36 h、48 h淀粉酶活性。取發(fā)酵液10 000×g離心6 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。使用α-淀粉酶試劑盒進(jìn)行淀粉酶活性測(cè)定。使用試劑處理后，OD540讀取光密度值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。
2結(jié)果
2.1噬菌體PJNB028形態(tài)
枯草芽孢桿菌噬菌體命名為PJNB028。如圖1所示，噬菌斑近圓形，邊緣有暈環(huán)，直徑約2 mm。
圖1噬菌體PJNB028噬菌斑形態(tài)
2.2噬菌體PJNB028全基因組分析
噬菌體PJNB028基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，全長(zhǎng)162 308 bp，G+C含量為34%。全基因組BLASTN比對(duì)結(jié)果表明，噬菌體PJNB028與枯草芽孢桿菌噬菌體Bacillus phage 2S-4相似度最高為100%。經(jīng)CARD網(wǎng)站預(yù)測(cè)PJNB028基因組中未發(fā)現(xiàn)耐藥基因、毒力基因。全基因組序列已提交至國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心(National Microbiology Data Center，NMDC)，編號(hào)NMDC60203838。
如圖2所示，PJNB028具有237個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)，含有13個(gè)tRNA基因(表1)，66個(gè)ORF編碼為已知功能蛋白質(zhì)。其中已知功能閱讀框分為5個(gè)功能模塊:裂解、復(fù)制、結(jié)構(gòu)與包裝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和未知模塊。2個(gè)ORF與裂解相關(guān)，30個(gè)ORF與DNA復(fù)制修復(fù)相關(guān)，18個(gè)ORF是結(jié)構(gòu)與包裝蛋白，16個(gè)ORF與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，其余為假定蛋白(hypothetical protein)。在ORF160和ORF161之間編碼了tRNA-Arg、tRNA-Arg、tRNA-Gly、tRNA-Ser、tRNA-Ser、tRNA-Thr、tRNA-Leu、tRNA-Cys和tRNA-Met，在ORF161和ORF162之間編碼了tRNA-Pro、tRNA-Glu、tRNA-Gly和tRNA-Asn。
圖2噬菌體PJNB028基因組圈圖
表1噬菌體PJNB028基因組中的tRNA基因
其中，與裂解相關(guān)的ORF131為穿孔素，作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，是一種疏水性跨膜蛋白。ORF133預(yù)測(cè)為L(zhǎng)ysM肽聚糖結(jié)合域蛋白，可能與細(xì)菌細(xì)胞壁的識(shí)別和相互作用有關(guān)，兩者相互配合聯(lián)合抑菌。18個(gè)ORF與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和包裝有關(guān)，ORF138(phage tail spike protein)結(jié)合多糖特定細(xì)菌宿主，有助于決定噬菌體侵染的專一性;ORF140(phage tail domain-containing protein)為噬菌體的尾部結(jié)構(gòu);ORF141(phage tail tape measure protein)用于測(cè)量噬菌體尾部長(zhǎng)度，控制尾部長(zhǎng)度，有助于噬菌體識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)菌。ORF157預(yù)測(cè)為末端酶大亞基，末端酶對(duì)啟動(dòng)DNA包裝至關(guān)重要。30個(gè)ORF與DNA復(fù)制相關(guān)，PJNB028編碼了許多與核酸修飾有關(guān)的蛋白質(zhì)，如ORF86DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、ORF104DNA連接酶、ORF128交叉連接內(nèi)脫氧核糖核酸酶RuvC等。通過NCBI結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ORF86是四型拓?fù)洚悩?gòu)酶。ORF33預(yù)測(cè)為含有DNA樣解旋酶C端結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，與DNA的復(fù)制和修復(fù)有關(guān)。ORF142(site-specific integrase)是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能夠在特定DNA序列之間進(jìn)行重組。16個(gè)ORF與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。ORF175(helix-turn-helix domain-containing protein)是含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，有研究表明該蛋白質(zhì)可用于調(diào)控CRISPR系統(tǒng)。ORF202(Rho termination factor N-terminal domain-containing protein)主要與轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控相關(guān)。ORF221(type II toxin-antitoxin system HicB family antitoxin)II型毒素-抗毒素系統(tǒng)是一種廣泛存在于細(xì)菌和古菌中的遺傳系統(tǒng)，有利于噬菌體PJNB028在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)生存。
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