油橄欖(Olea europaea L.)屬木犀科木犀欖屬，其具有較強(qiáng)的抵抗微生物侵襲能力[1]，可生長(zhǎng)幾百年。油橄欖葉提取物早已被地中海地區(qū)的人們當(dāng)作民間醫(yī)藥來治療發(fā)燒和其他疾病如瘧疾等[2]。油橄欖葉提取物具有強(qiáng)的抑菌活性并可分離出橄欖苦苷且含量很高[3]。橄欖苦苷是一種無毒、易被人體吸收[4]的苯酚類裂環(huán)環(huán)烯醚帖苷化合物，有清除超氧陰離子自由基(O2-·)、過氧化氫(H2O2)、NO和過氧亞硝基陰離子(ONOO-)的能力[5]，還有抗癌[6-7]、抗血栓[8]、預(yù)防動(dòng)脈硬化和神經(jīng)保護(hù)[9-10]等作用。
本實(shí)驗(yàn)通過評(píng)價(jià)橄欖苦苷的體外抗氧化活性和抑菌活性，為油橄欖葉和橄欖苦苷的藥理活性研究、拓寬應(yīng)用途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
1、橄欖苦苷體外抗氧化活性分析
（1）總抗氧化能力
在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ可被還原性物質(zhì)還原為Fe2+-TPTZ形式，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，于593 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收峰。在Fe3+-TPTZ過量的情況下，檢測(cè)藍(lán)色物質(zhì)的生成量可以反映待測(cè)物質(zhì)的總抗氧化能力。如圖2所示，橄欖苦苷總抗氧化能力明顯強(qiáng)于BHT(butylatedhydroxytoluene簡(jiǎn)稱，中文名抗氧劑264)，在0.02～0.08 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)橄欖苦苷和BHT總抗氧化能力與其質(zhì)量濃度成正相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)橄欖苦苷抗氧化能力為(52.90±1.58)%，BHT為(48.46±0.03)%。橄欖苦苷總抗氧化能力的IC50為(0.075±0.002)mg/mL，在研究質(zhì)量濃度范圍內(nèi)BHT總抗氧化能力低于50%。
（2）總還原能力
由K3Fe(CN)6反應(yīng)成K4Fe(CN)6，并進(jìn)一步生成Fe 4[Fe(CN)6]3，這是一有色反應(yīng)的過程，在700 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，吸光度越大則樣品的還原力越強(qiáng)。如圖3所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時(shí)，橄欖苦苷總還原能力為(87.59±0.12)%，BHT為(74.66±3.61)%。橄欖苦苷IC50為(0.014±0.001)mg/mL，BHT的IC50為(0.023±0.003)mg/mL，IC50差值約0.010 mg/mL，表明橄欖苦苷的總還原能力強(qiáng)于BHT。橄欖苦苷比BHT有更強(qiáng)的總抗氧化能力和總還原能力，這可能是因?yàn)榱u基鄰位二取代的結(jié)構(gòu)使其具有更強(qiáng)的穩(wěn)定和抗氧化活性[11]。
2、橄欖苦苷抑菌活性分析
（1）抑菌活性
橄欖苦苷對(duì)3種細(xì)菌的抑菌圈大小和細(xì)菌的敏感程度如表1所示。3種細(xì)菌對(duì)甲醇表現(xiàn)出不敏感或敏感度不明顯，橄欖苦苷對(duì)3種細(xì)菌都有抑菌作用。在不同質(zhì)量濃度下，橄欖苦甙對(duì)3種細(xì)菌的敏感度也不同。
結(jié)果顯示橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，其次為金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌對(duì)橄欖苦苷表現(xiàn)出敏感度不高。眾所周知，苯酚類或抗氧化物通過與細(xì)胞的肽聚糖作用破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或損害細(xì)胞膜，兩者一起作用抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。由于橄欖苦苷羥基鄰位二取代結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性強(qiáng)，以及大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)細(xì)胞壁肽聚糖含量低和層次少，橄欖苦苷易于進(jìn)入和產(chǎn)生抑制作用。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密，以及芽孢強(qiáng)抗逆性使得橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌的作用較弱。
3、橄欖苦苷對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響
(1)橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的影響
大腸桿菌在添加不同質(zhì)量濃度橄欖苦苷培養(yǎng)基中培育36 h的生長(zhǎng)狀況如圖4所示。
無菌水代替橄欖苦苷溶液的培養(yǎng)基中細(xì)菌在培養(yǎng)6 h后細(xì)菌數(shù)增長(zhǎng)明顯加快，6～12 h為大腸桿菌的快速生長(zhǎng)期。在以甲醇(0.00 mg/mL)代替橄欖苦苷溶液的培養(yǎng)基中大腸桿菌在培養(yǎng)6 h后細(xì)菌數(shù)開始增長(zhǎng)，1 2 h后適應(yīng)環(huán)境并快速繁殖，在12～18 h處于快速生長(zhǎng)期并達(dá)到最大菌液濃度，與無菌水組比較，此時(shí)細(xì)菌的快速生長(zhǎng)期相對(duì)延緩，說明甲醇對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有一定的影響。當(dāng)添加質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL橄欖苦苷溶液時(shí)，培養(yǎng)到18 h后大腸桿菌開始增長(zhǎng)，在培養(yǎng)24～30 h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期。橄欖苦苷質(zhì)量濃度為0.05、0.10 mg/mL時(shí)，在培養(yǎng)24 h后細(xì)菌生長(zhǎng)并快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)30 h后細(xì)菌數(shù)還在增加。在質(zhì)量濃度為0.50、1.00 mg/mL時(shí)，36 h內(nèi)大腸桿菌的生長(zhǎng)完全被抑制，說明橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度<0.50 mg/mL。表明大腸桿菌隨著橄欖苦苷質(zhì)量濃度的增加，快速生長(zhǎng)期被相應(yīng)延緩或推遲，細(xì)菌的生長(zhǎng)周期被相應(yīng)延長(zhǎng)，但是對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率沒有受到多大影響。
(2)橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響
如圖5所示，在添加無菌水培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)6 h后數(shù)目增加，在培養(yǎng)12 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期，培養(yǎng)18 h附近達(dá)最大吸光度，此后細(xì)菌數(shù)開始緩慢降低。甲醇組(0.00 mg/mL)中的細(xì)菌在培養(yǎng)12 h后細(xì)菌數(shù)增加較快，18 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)24 h后達(dá)最大菌液濃度，此時(shí)對(duì)數(shù)期相對(duì)無菌水組被延緩，說明甲醇對(duì)金黃色葡萄球菌有一定抑菌作用。在加有質(zhì)量濃度為0.01、0.05 mg/mL橄欖苦苷溶液的培養(yǎng)基中，金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)18 h后繁殖較快，數(shù)目增加明顯，24 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)30 h后金黃色葡萄球菌數(shù)趨于穩(wěn)定。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)18 h細(xì)菌開始適應(yīng)環(huán)境，24 h后進(jìn)行快速生長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期出現(xiàn)在培養(yǎng)至24～30 h之間。質(zhì)量濃度為0.50、1.00 mg/mL時(shí)36 h內(nèi)橄欖苦苷完全抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，此時(shí)生長(zhǎng)曲線為水平狀態(tài)，表明橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度<0.50 mg/mL。橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響同樣表現(xiàn)在對(duì)細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的延緩。
(3)橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響
由圖6可知，無菌水組和甲醇組的枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線趨于一致，在培養(yǎng)6 h后細(xì)菌數(shù)開始增長(zhǎng)，6～12 h處于快速生長(zhǎng)期，此后細(xì)菌數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定并開始降低，說明甲醇對(duì)枯草芽孢桿菌影響不大或沒有抑制作用。當(dāng)橄欖苦苷質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌的快速生長(zhǎng)被延緩到12～24 h，此時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期被延緩，細(xì)菌生長(zhǎng)速率減慢且所需時(shí)間范圍變大。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)18 h后細(xì)菌數(shù)迅速增加，于18～24 h達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。橄欖苦苷質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時(shí)，36 h內(nèi)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)被完全抑制，表明橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度<1.00 mg/mL。橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的影響表現(xiàn)在細(xì)菌數(shù)開始增加到進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和菌液濃度達(dá)最大所需的時(shí)間范圍被延長(zhǎng)，主要還是表現(xiàn)為對(duì)快速生長(zhǎng)時(shí)期的抑制作用。
分別以無菌水和甲醇作為對(duì)照，比較不同質(zhì)量濃度橄欖苦苷對(duì)3種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響，結(jié)果如表2所示，甲醇對(duì)枯草芽孢桿菌的影響很小或沒有抑制作用，甲醇對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，但是在抑菌圈測(cè)試中，這種作用不明顯，可能是甲醇量少、易揮發(fā)以及橄欖苦苷在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散效果不好，且微溶于水所致。無論以無菌水還是甲醇作為對(duì)照，橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效果最佳，對(duì)數(shù)期被延緩18、12 h。橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果其次，在0.01、0.05 mg/mL質(zhì)量濃度時(shí)，金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期被延緩12 h，質(zhì)量濃度達(dá)0.10 mg/mL時(shí)被延緩18 h，以甲醇為對(duì)照被延緩12 h。橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制效果相對(duì)較弱，在0.01～0.10 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，橄欖苦苷對(duì)其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期都延緩6 h，在質(zhì)量濃度0.50 mg/mL時(shí)被延緩12 h。橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度范圍分別為<0.50 mg/mL、<0.50 mg/mL、<1.00 mg/mL。
采用稀釋法分析橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度(圖7)，在質(zhì)量濃度<0.2 mg/mL時(shí)，橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制作用較強(qiáng)，對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用較弱。當(dāng)橄欖苦苷質(zhì)量濃度≥0.025 mg/mL時(shí)，大腸桿菌吸光度趨為零，因此橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度(minimalinhibitory concentration，MIC)為0.025 mg/mL;當(dāng)橄欖苦苷質(zhì)量濃度≥0.05 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌沒有生長(zhǎng)，MIC為0.05 mg/mL。有研究報(bào)道[21]橄欖苦苷對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為0.0312～0.125 mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合;枯草芽孢桿菌隨橄欖苦苷質(zhì)量濃度的增加細(xì)菌數(shù)減少、生長(zhǎng)減慢，在質(zhì)量濃度>0.1 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)液的吸光度迅速降低，此時(shí)橄欖苦苷濃度細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)被完全抑制，此為其最低抑菌濃度。
4、結(jié)論
橄欖苦苷體外抗氧化和抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：橄欖苦苷具有強(qiáng)的體外抗氧化活性和抑菌作用。在0.02～0.08 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與BHT相比較，橄欖苦苷表現(xiàn)出強(qiáng)的總抗氧化能力和總還原能力，總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果表明，橄欖苦苷的IC50為(0.075±0.002)mg/mL，而此時(shí)BHT的抗氧化率低于50%;總還原能力測(cè)定結(jié)果表明，橄欖苦苷的IC50為(0.014±0.001)mg/mL，BHT的IC50為(0.023±0.003)mg/mL，差值為0.010 mg/mL。在所研究質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，橄欖苦苷對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑可達(dá)(20.77±0.47)mm，MIC為0.025 mg/mL;金黃色葡萄球菌對(duì)橄欖苦苷表現(xiàn)出高度敏感(d=(19.23±0.44)mm)，MIC為0.05 mg/mL;而橄欖苦苷對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用相對(duì)較弱，處于中度敏感狀態(tài)，MIC為0.4 mg/mL。橄欖苦苷對(duì)3種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響表現(xiàn)在對(duì)其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的延緩。對(duì)大腸桿菌的抑制作用極顯著強(qiáng)于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌(P<0.01)，金黃色葡萄球菌對(duì)橄欖苦苷的敏感度高于枯草芽孢桿菌(P<0.05)。這為橄欖苦苷在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和研究提供了參考。
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