3討論
APP引起豬的傳染性胸膜肺炎，在全球范圍內(nèi)分布廣泛。APP血清型眾多，具體流行情況又根據(jù)時(shí)間和地區(qū)的不同而存在顯著差異，其疫苗菌株需要根據(jù)流行毒株的變化而不斷更新。隨著時(shí)間變化，近幾年國內(nèi)5型、8型及15型等血清型也表現(xiàn)出流行趨勢，而3型菌株檢出率有所降低。國內(nèi)現(xiàn)有的商品化滅活疫苗主要針對血清型1、2、7型，而本研究從2021—2022年采集鑒定到的53株APP臨床菌株鑒定到1型25株、5型3株、7型20株、8型1株、15型4株，以1型和7型為主，5型和15型次之，8型相對較少，未檢測到血清型2型和3型。目前商品化疫苗可能不能再滿足臨床APP防控需求，需要更新疫苗候選毒株。
為了探究分離菌株的生物學(xué)特性，首先對臨床菌株的生長曲線、溶血活性及耐藥性進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，15型菌株體外生長速率最快。結(jié)合國內(nèi)APP的流行趨勢，近年來，包括15型菌在內(nèi)的10型之后的血清型流行率明顯增加，這提示15型菌株在自然環(huán)境中可能具備較強(qiáng)的生存競爭力，其快速生長的特性可能有助于其在宿主體內(nèi)迅速增殖，從而增加了其成為臨床感染中主要血清型的潛在風(fēng)險(xiǎn)。在APP治療手段方面，抗生素使用仍然重要手段，2014—2015年安徽地區(qū)分離到的臨床APP菌株對氟苯尼考都較為敏感，但近年來，APP對氯霉素類藥物耐藥性呈上升趨勢。本研究對臨床菌株耐藥性檢測結(jié)果表明臨床APP對恩諾沙星、青霉素、頭孢噻呋最為敏感，而對多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺二甲嘧啶的耐藥性明顯升高，這可能與當(dāng)?shù)嘏R床上藥物的使用頻率增加有關(guān)。
大蠟螟較容易獲取，并且在實(shí)驗(yàn)室條件下易于養(yǎng)殖，目前已廣泛用于各種大規(guī)模實(shí)驗(yàn)，也是APP等病原菌毒力初步檢測的重要模型之一。該模型在樣本數(shù)量大的毒力評估實(shí)驗(yàn)中有突出優(yōu)勢，操作方便，在本研究中顯著降低了疫苗菌株篩選成本。雖然大蠟螟在毒力評估、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)等方面可以作為模型生物，但其生理和行為特性在某些情況下可能與更高級的模型生物有所不同，這限制了其在不同研究領(lǐng)域的適用性。因此，本研究首先使用大蠟螟幼蟲初篩數(shù)量較多的血清1型、7型菌株，然后利用小鼠模型進(jìn)一步篩選出1型、5型、7型和15型強(qiáng)毒株各一株，二者結(jié)果相結(jié)合分析，提高了毒力篩選的效率和正確率。國內(nèi)現(xiàn)有的商品化滅活疫苗主要針對血清型1、2、7型。有學(xué)者將分離到的APP血清型12菌株制備滅活疫苗，發(fā)現(xiàn)其對1型APP感染小鼠產(chǎn)生40%的保護(hù)率，但對5b型APP感染不能提供有效的保護(hù)效力。這顯示不同血清型菌株的交叉保護(hù)效果較差。血清型15型在近幾年分離率逐漸升高，王玉國等已證明15型成為河南省優(yōu)勢血清型。2024年新疆某豬場爆發(fā)豬傳染性胸膜肺炎，分離鑒定確定流行菌株為15型。本研究將篩選出的各血清型候選菌株制備成單價(jià)滅活疫苗，并在小鼠上評價(jià)了免疫保護(hù)效果。對于15型臨床分離菌株，攻毒后，臨床菌株組小鼠存活率（66.7%）高于商品化疫苗免疫組（50%），因此商品化疫苗中1、2、7型對15型具有一定的交叉保護(hù)作用，但本研究結(jié)果獲得的15型菌株保護(hù)力更高，這些結(jié)果為血清15型的疫苗研制提供參考。而對于長期流行的血清型1型臨床菌株，本研究中的菌株免疫劑量不到商品化疫苗中1型菌株的1/5，保護(hù)效果卻與商品化疫苗均達(dá)到100%，這表明該菌株具有很好的疫苗開發(fā)潛力，可以通過優(yōu)化疫苗各組分劑量來提高免疫保護(hù)效果。同時(shí)，本試驗(yàn)采用的氫氧化鋁作為疫苗佐劑，在滅活疫苗制備中廣泛應(yīng)用，其主要優(yōu)勢在于能夠顯著增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。但在強(qiáng)化細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答方面效果不那么顯著，不同佐劑的選擇在滅活疫苗的研究中也影響抗原免疫原性，也可能是臨床分離株滅活疫苗和商品化疫苗存在差異的原因。后續(xù)可對不同的佐劑和滅活方式進(jìn)行評估，從而制備對APP感染更佳保護(hù)效果的疫苗。
4結(jié)論
本研究從國內(nèi)十個(gè)省份的豬場分離菌株中鑒定到APP 1型25株、5型3株、7型20株、8型1株、15型4株，各血清型菌株在體外生長存活能力強(qiáng)，具有不同程度的溶血活性。用大蠟螟和小鼠感染模型在血清型1、5、7、15型中各篩選到一株高毒力滅活疫苗候選菌株。其中，1型菌株滅活后能夠以小于商品化疫苗中1型菌株的1/5的劑量，在同血清型攻毒實(shí)驗(yàn)中保護(hù)100%小鼠存活，15型菌株為商品化疫苗菌株中缺乏的菌株，其制備的滅活疫苗也能對同血清型攻毒小鼠提供保護(hù)，這些菌株具備開發(fā)為疫苗候選菌株的潛在價(jià)值。
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