變形鏈球菌形成生物膜和在酸性pH下存活的能力被認為是齲齒發(fā)病機制中的兩個重要毒力決定因素。環(huán)境刺激被認為通過雙組分信號轉導系統(tǒng)的活性來調(diào)節(jié)幾種與毒力因子相關基因的表達。然而，關于這些系統(tǒng)在變形鏈球菌生理和致病性中的作用知之甚少。
在本研究中，我們描述了一個雙組分調(diào)控系統(tǒng)及其在變形鏈球菌生物膜形成和酸耐受性中的作用。通過使用肺炎鏈球菌的HK03和RR03蛋白序列作為查詢詞，在變形鏈球菌基因組數(shù)據(jù)庫中進行tblastn搜索，我們鑒定出兩個基因，命名為hk11和rr11，它們分別編碼一個推定的組氨酸激酶及其同源應答調(diào)節(jié)蛋白。為了深入了解它們的功能，我們采用PCR介導的等位基因交換誘變策略，從變形鏈球菌野生型NG8中創(chuàng)建了hk11（Em?）和rr11（Em?）缺失突變體，分別命名為SMHK11和SMRR11。對這些突變體的生長速率、遺傳感受態(tài)、形成生物膜的能力以及對低pH挑戰(zhàn)的耐受性進行了檢測。結果顯示，刪除hk11或rr11會導致生物膜形成缺陷和對酸性pH的耐受性降低。兩種突變體形成的生物膜生物量減少（約為親本菌株密度的50%至70%）。
掃描電子顯微鏡觀察顯示，突變體形成的生物膜具有海綿狀結構，其中似乎存在大的間隙，類似于水通道樣結構。突變體的生物膜由比親本生物膜更長的細胞鏈組成。刪除hk11還導致對低pH的耐受性大大降低，盡管我們在刪除rr11時沒有觀察到相同的效果。兩種突變體的遺傳感受態(tài)均未受影響。結果表明，變形鏈球菌中hk11的基因產(chǎn)物可能作為pH傳感器，可以與一個或多個應答調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生交叉對話。我們得出結論，由hk11和rr11編碼的雙組分信號轉導系統(tǒng)代表了一個參與變形鏈球菌生物膜形成和酸耐受性的新調(diào)控系統(tǒng)。
雙組分信號轉導系統(tǒng)通過感知環(huán)境變化并調(diào)節(jié)基因表達以響應各種刺激，在細菌適應、生存和毒力中發(fā)揮作用。一個典型的雙組分調(diào)控系統(tǒng)包括一個膜相關的組氨酸激酶傳感器蛋白（感知特定的環(huán)境條件）和一個細胞質(zhì)應答調(diào)節(jié)蛋白（當條件變化時通過調(diào)節(jié)基因表達使細胞能夠響應）。在受到特定配體或信號刺激時，組氨酸激酶傳感器蛋白在保守的組氨酸殘基處發(fā)生自身磷酸化。然后，磷酸基團被轉移到同源應答調(diào)節(jié)蛋白，后者進而可以激活或抑制靶基因的轉錄。已有研究表明，雙組分調(diào)控系統(tǒng)在多種細菌物種中調(diào)節(jié)多樣的代謝過程、細菌細胞周期、細胞間通訊和毒力因子。由于它們在調(diào)節(jié)細胞生理、環(huán)境適應和毒力表達方面的重要性，雙組分調(diào)控系統(tǒng)已被用作開發(fā)抗菌劑的目標。
變形鏈球菌是一種進化出生物膜生活方式以在其自然生態(tài)系統(tǒng)——牙菌斑中生存和持續(xù)存在的細菌。在適當?shù)沫h(huán)境條件下，變形鏈球菌可以從膳食可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生足夠量的酸，并導致牙釉質(zhì)脫礦-再礦化過程失衡，從而引發(fā)齲齒。變形鏈球菌引發(fā)齲齒的能力取決于幾個與毒力相關的特性，包括：（i）通過在其合成的不溶性細胞外多糖促進下粘附并積聚在牙齒表面來啟動生物膜形成；（ii）高效分解碳水化合物并產(chǎn)酸；以及（iii）在低pH下生長和繼續(xù)代謝碳水化合物的能力。環(huán)境因素在調(diào)節(jié)變形鏈球菌這些毒力相關特性中起著重要作用。盡管有許多研究證明了環(huán)境刺激在調(diào)節(jié)變形鏈球菌生理和毒力特性方面的重要性，但關于變形鏈球菌響應其環(huán)境波動而調(diào)節(jié)這些毒力特性表達的分子機制知之甚少。
我們最近在變形鏈球菌中描述了一個由雙組分系統(tǒng)（ComDE）組成的群體感應信號系統(tǒng)。該系統(tǒng)響應其天然信號肽信息素并激活許多對誘導遺傳感受態(tài)至關重要的基因的轉錄，導致自然轉化。我們之前的工作表明，該系統(tǒng)似乎在變形鏈球菌的遺傳感受態(tài)、生物膜形成和酸耐受反應中扮演全局調(diào)控角色。在本研究中，我們描述了一個新的雙組分調(diào)控系統(tǒng)，并開始評估該系統(tǒng)在變形鏈球菌生物膜形成和酸耐受性中的作用。
材料與方法
細菌菌株、培養(yǎng)基和化學品。 本研究使用的菌株及其相關特性列于表1。變形鏈球菌野生型菌株NG8常規(guī)在Todd-Hewitt酵母提取物瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，而突變體則在THYE瓊脂中加入10μg/ml紅霉素進行維持。除非另有說明，常規(guī)使用THYE液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株。為了培養(yǎng)生物膜，制備了一種半限定最小培養(yǎng)基，該方法是對先前描述的方法的修改。該培養(yǎng)基含有58 mM K?HPO?、15 mM KH?PO?、10 mM (NH?)?SO?、35 mM NaCl和2 mM MgSO?·7H?O，并補充了過濾滅菌的維生素、氨基酸、0.2% Casamino Acids和20 mM葡萄糖。所有菌株的生物膜在聚苯乙烯微孔板中于SDM培養(yǎng)基中，37°C，5% CO?條件下培養(yǎng)16小時后進行定量和顯微鏡檢查。
| 菌株/擴增子/質(zhì)粒 | 相關特性 | 來源或參考文獻 |
|---|---|---|
| 變形鏈球菌菌株 | ||
| NG8 | 野生型，Em?（紅霉素敏感） | A. S. Bleiweis，佛羅里達大學 |
| SMHK11 | NG8△hk11::PcEm，Em?（紅霉素抗性） | 本研究 |
| SMRR11 | NG8△rr11::PcEm，Em? | 本研究 |
| 擴增子 | ||
| PcEm | 帶有合成啟動子的Em?標記，從ermAM盒擴增 | 參考文獻4 |
| aHK11 | HK11-up::PcEm::HK11-dw，用于hk11的等位基因替換 | 本研究 |
| aRR11 | RR11-up::PcEm::RR11-dw，用于rr11的等位基因替換 | 本研究 |
| 質(zhì)粒 | ||
| pDL289 | 大腸桿菌-鏈球菌穿梭載體；Km?（卡那霉素抗性） | 參考文獻2 |
| 引物 | 核苷酸序列（5'→3'） | 擴增子大?。╞p） |
|---|---|---|
| HK11-P1 | CTGAAGGAAGCCTTATGCG | 763 |
| HK11-P2 | GGCGCGCCCCGGAAATGATGGTAACTGCCG | - |
| HK11-P3 | GGCCGGCCAAGTGCTGAAAAGGGGG | 666 |
| HK11-P4 | CATAGACAACGGCTTGGGTC | - |
| RR11-P1 | AACGCCACCTCAACCAAA | 887 |
| RR11-P2 | GGCGCGCCGCCTCACCGATAACTTCTACATT | - |
| RR11-P3 | GGCCGGCCCCTTCAGCATCATTTAGTGCCAC | 565 |
| RR11-P4 | CACCCACATCCTCAAAGGTC | - |
| Em cst-P1 | GGCGCGCCCCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT | 860 |
| Em cst-P2 | GCTGGCCGGCCAGTCGGCAGCGACTCATAGAAT | - |
構建hk11和rr11缺失突變體。 我們開始搜索俄克拉荷馬大學OU-ACGT網(wǎng)站的變形鏈球菌基因組數(shù)據(jù)庫，尋找在肺炎鏈球菌中鑒定出的13個TCSTSs的同源物。使用肺炎鏈球菌的HK03和RR03蛋白序列作為查詢詞進行tblastn搜索，鑒定出兩個與肺炎鏈球菌的hk3和rr3基因同源的基因。這兩個基因被命名為hk11和rr11，分別編碼變形鏈球菌中一個推定的組氨酸激酶及其同源應答調(diào)節(jié)蛋白。本研究重點評估這個命名為HK/RR11的TCSTS在變形鏈球菌生物膜形成和酸耐受性中的功能。我們通過一個快速的基于PCR的缺失策略，在變形鏈球菌野生型菌株NG8中構建了hk11和rr11基因的單獨缺失突變體，該策略涉及限制性內(nèi)切酶連接和等位基因替換，如先前所述。用于構建和確認基因缺失的引物列于表2。例如，為了構建hk11突變體，使用引物HK11-P1和HK11-P2（其5'端含有一個AscI位點）從變形鏈球菌NG8基因組DNA中擴增出hk11起始密碼子5'端的763 bp片段（HK11-up）。另一個擴增子，命名為HK11-dw，是hk11 3'端的666 bp片段，使用HK11-P3（5'端帶有FseI位點）和HK11-P4引物擴增。一個紅霉素抗性標記PcEm（860 bp），來自合成的Em?盒，使用引物Em cst-P1和Em cst-P2（其5'端分別設計了AscI和FseI位點）進行擴增。這些擴增子經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化和隨后的連接，產(chǎn)生HK11-up::PcEm::HK11-dw片段。連接產(chǎn)物直接用于轉化變形鏈球菌野生型菌株NG8，并借助合成的感受態(tài)刺激肽。通過雙交換同源重組后，hk11基因的內(nèi)部區(qū)域被紅霉素盒完全替換。使用類似的策略構建rr11缺失突變體。
通過PCR確認突變體中PCR構建體的整合位點。簡而言之，通過先前描述的方法從在THYE-紅霉素（10μg/ml）瓊脂平板上選擇的轉化子中制備基因組DNA。然后使用突變體和野生型基因組DNA作為模板，用三種引物組合（P1和Em cst-P2，P4和Em cst-P1，以及P1和P4）進行PCR，根據(jù)預測的產(chǎn)物大小驗證構建體正確重組到突變體基因組中。使用野生型（NG8）基因組DNA作為陰性對照。
生長速率。 在SDM培養(yǎng)基和補充了20 mM葡萄糖的胰蛋白胨-酵母提取物培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，使用Bioscreen微生物生長曲線分析儀（Bioscreen C Labsystems, Helsinki, Finland）和一次性多孔微孔板測定它們的生長動力學。Bioscreen配備了允許記錄濁度讀數(shù)并將其轉換為生長曲線的軟件。將等濁度的細胞懸浮液等分試樣（4μl）接種到每個含有400μl新鮮培養(yǎng)基的孔中。在總共20小時內(nèi)，每15分鐘短暫搖動后記錄培養(yǎng)物的濁度。每個樣品進行三次重復測定，并使用三個無細胞的孔作為空白對照。
遺傳轉化。 為了確定hk11或rr11的失活是否對遺傳感受態(tài)的發(fā)展有任何影響，使用先前描述的方案檢測突變體的遺傳轉化能力。簡而言之，將過夜培養(yǎng)物用2 ml預溫的新鮮THYE肉湯（補充了5%馬血清）稀釋，生成1:20和1:40的稀釋液。將培養(yǎng)物在37°C、5% CO?條件下培養(yǎng)2小時，使?jié)岫冗_到600 nm處光密度為1.5至2.0單位。然后將每個樣品分成兩份：一份含有1μg/ml轉化質(zhì)粒DNA（pDL289, Km?），另一份含有相同濃度的轉化質(zhì)粒DNA和新鮮制備的CSP（終濃度為500 ng/ml）。培養(yǎng)2至3小時后，輕輕超聲處理10秒以分散鏈球菌鏈，將細胞懸浮液等分試樣（100μl）涂布在含有卡那霉素（700 ng/ml）的THYE平板上。將適當稀釋后的細胞懸浮液等分試樣也涂布在不含抗生素的THYE平板上以確定總受體細胞數(shù)。親本菌株NG8的轉化作為陽性對照。轉化頻率表示為每毫升細胞懸浮液中轉化子數(shù)除以總受體細胞數(shù)。
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