2方法及結(jié)果
2.1枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液制備
將枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置35℃培養(yǎng)24h,取以上新鮮培養(yǎng)物1mL,用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-3~10-7,做活菌計(jì)數(shù)備用。
2.2不同水活度培養(yǎng)基的配制
參照USP<1112〉表1.微生物生長所需的最低水分活度(aw),枯草芽孢桿菌的最低水分活度(aw)是0.90{}^{[4]}。分別使用氯化鈉、蔗糖、甘油3種水分活度調(diào)節(jié)劑,調(diào)節(jié)TSB水分活度在枯草芽孢桿菌的最低水分活度附近，即低于水分活度限值0.01單位、水分活度限值和高于水分活度限值0.01單位，以及沒有調(diào)節(jié)水分活度的TSB,分別用T{}_{L}、T、T_{H}和T。表示。3種調(diào)節(jié)劑使用量見表1。
2.3繪制枯草芽孢桿菌生長曲線
取“2.1”項(xiàng)下制備的菌懸液(每1mL含約10 cfu)1 mL加入到“2.2”項(xiàng)下配制的培養(yǎng)基中，使得各種培養(yǎng)基中菌液濃度約每1 mL含100 cfu,T、T、T_{H}為實(shí)驗(yàn)組,T_{0}為對照組。
將加菌后的T_{L}、T、T_{H}和T_{0}置35℃培養(yǎng),分別在0、2、4、6、8、12、36、48、75、104和144h時(shí)間點(diǎn)，取1 mL接種置平皿中,傾注TSA,于35℃培養(yǎng)48h,每個時(shí)間點(diǎn)每組平行測定2個平皿，計(jì)數(shù)。再將測得的菌落數(shù)(cfu)取對數(shù)值和相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)作圖,繪制生長速率曲線，每個驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行3次。
2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.4.1氯化鈉調(diào)節(jié)介質(zhì)
以氯化鈉做水分活度調(diào)節(jié)介質(zhì)，各水分活度下枯草芽孢桿菌的生長曲線見圖1~4。
2.4.2蔗糖調(diào)節(jié)介質(zhì)
以蔗糖做水分活度調(diào)節(jié)介質(zhì),各水分活度下枯草芽孢桿菌的生長曲線見圖5~7。
2.4.3甘油調(diào)節(jié)介質(zhì)
以甘油做水分活度調(diào)節(jié)介質(zhì),各水分活度下枯草芽孢桿菌的生長曲線見圖8~10。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)及生長曲線可以看出，在(aw)=0.91水分活度條件下,枯草芽孢桿菌在氯化鈉、蔗糖2種介質(zhì)中的生長曲線趨勢基本一致，在24h后進(jìn)入快速增長期，菌濃度明顯增加。在甘油介質(zhì)中，枯草芽孢桿菌從32h開始明顯生長。
在(aw)=0.90水分活度條件下,上述3種介質(zhì)的枯草芽孢桿菌生長曲線趨勢基本一致，都在50h后快速增長。在(aw)=0.89水分活度條件下,3種介質(zhì)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中，枯草芽孢桿菌數(shù)最后都接近或降為0,生長曲線趨勢均為逐漸下降,說明該水分活度條件下枯草芽孢桿菌的生長受到抑制。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，基本可以驗(yàn)證0.90是枯草芽孢桿菌生長所需的最低水分活度值。通過對氯化鈉、蔗糖、甘油3種介質(zhì)在不同水分活度水平下微生物的持續(xù)監(jiān)測，可以看出水分活度會影響微生物的生長情況。微生物生長是水分活度、溫度、營養(yǎng)條件等各方面環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果。在溫度、營養(yǎng)條件相同的情況下，調(diào)節(jié)水分活度可以影響微生物的生長。
3討論
目前水分活度概念已經(jīng)作為預(yù)測微生物生長，反映產(chǎn)品穩(wěn)定性和安全性的參數(shù)。水分活度影響微生物的代謝，微生物的繁殖、孢子的萌發(fā)和生存都需要可利用水。每種微生物都有一個(aw)臨界值，在(aw)較高時(shí),微生物生長繁殖快,在低于(aw)臨界值時(shí)，微生物生長緩慢甚至停止生長。因此,通過測量和控制產(chǎn)品的水分活度可以減少或消除微生物的增殖風(fēng)險(xiǎn)。目前《美國藥典》、《歐洲藥典》、《日本藥局方》都提出了降低藥品水分活度對預(yù)防潛在微生物的概念，我國水分活度主要應(yīng)用在食品保存方面在藥品安全方面應(yīng)用較少。
本實(shí)驗(yàn)參考USP41<1112>“水分活度測定在非無菌產(chǎn)品中的應(yīng)用”中表1(以下簡稱USP1112表1)所列，及《中國藥典》2015年版微生物限度檢查法中常用代表菌株，選擇枯草芽孢桿菌作為研究對象。USP1112表1中提供了在25℃時(shí)一系列與制藥相關(guān)的代表性微生物生長所需的最低水分活度left((aw)right)^{[2]},枯草芽孢桿菌的最低水分活度((aw))為0.90,Hosono等[16]的研究結(jié)論與USP收載的結(jié)果并不一致。本實(shí)驗(yàn)旨在對枯草芽孢桿菌生長所需最低水活度進(jìn)行研究與驗(yàn)證。查閱文獻(xiàn)[1,6,8,17]水分活度使用較多的有甘油、氯化鈉、葡萄糖、乙二醇、山梨糖醇等，基于調(diào)節(jié)劑的食用安全性及易獲得性考慮，選取氯化鈉、蔗糖、甘油分別作為本實(shí)驗(yàn)的水分活度調(diào)節(jié)劑。微生物對水分活度非常敏感，微小的波動即會影響其生長。將(aw)調(diào)節(jié)為0.89、0.90、0.91作為枯草芽孢桿菌的生長條件，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，重現(xiàn)性較好。
水分活度的測定采用露點(diǎn)/冷面鏡法，該法具有精確度高、檢測速度快等特點(diǎn)[18]。水分活度測定受環(huán)境影響較大，因此在恒溫、恒濕的環(huán)境中檢測結(jié)果較為穩(wěn)定。培養(yǎng)基滅菌前、滅菌后水活度變化在±0.01內(nèi)。由于培養(yǎng)基裝于帶塞錐形瓶中，處于封閉狀態(tài)，濕熱滅菌對培養(yǎng)基水分活度影響不大。
本實(shí)驗(yàn)繪制各介質(zhì)中不同水分活度的時(shí)間生長曲線。驗(yàn)證枯草芽孢桿菌最低水分活度為0.90。在枯草芽孢桿菌為最大潛在污染物的藥品中，可以通過優(yōu)化處方、包裝材料或儲存方式，設(shè)計(jì)和控制藥品水分活度，降低微生物增殖風(fēng)險(xiǎn)，提高藥品的安全性和穩(wěn)定性，對于節(jié)約藥品成本，提高檢驗(yàn)效率，提升產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的指導(dǎo)意義[19]。
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