產(chǎn)肺炎碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌（KPC-PA）分離株在中國迅速擴(kuò)增，尤其是高?？寺T463。旨在探索推動ST463克隆成功的KPC相關(guān)質(zhì)粒的進(jìn)化。本研究對2011—2020年收集的1258株臨床銅綠假單胞菌菌株進(jìn)行全基因組測序，識別出106株ST463-PA菌株，其中KPC的檢出率為90.6%。研究發(fā)現(xiàn)在早期（2011—2012年），ST463-PA獲得了編碼KPC的II型（pT2-KPC）或I型質(zhì)粒（pT1-KPC）以克服碳青霉烯類抗生素的壓力。2012—2017年間，由于pT1-KPC質(zhì)粒具有較低的適應(yīng)性成本和IS26驅(qū)動的blaKPC擴(kuò)增能力，其成為主導(dǎo)質(zhì)粒。到2017—2020年，pT1-KPC質(zhì)粒發(fā)生大片段缺失，形成了pT1del-KPC質(zhì)粒。該質(zhì)粒具有更低的適應(yīng)性成本、增強(qiáng)的blaKPC-2基因穩(wěn)定性和更大的拷貝數(shù)靈活性，同時保持了水平傳播能力。因此pT1del-KPC質(zhì)粒最終取得成功，使ST463成為中國的主要ST。研究還評估了不同質(zhì)粒模式在ST463遺傳背景下的適應(yīng)性成本，并發(fā)現(xiàn)攜帶pT1del-KPC質(zhì)粒的菌株在無抗生素或高濃度美羅培南條件下比攜帶pT1-KPC質(zhì)粒的菌株具有更高的適應(yīng)性。在低濃度美羅培南壓力下，pT1del-KPC質(zhì)粒通過增加質(zhì)?？截悢?shù)來放大blaKPC-2基因，而pT1-KPC質(zhì)粒則通過IS26介導(dǎo)的blaKPC-2基因擴(kuò)增來響應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了進(jìn)化壓力推動ST463優(yōu)勢的形成，并強(qiáng)調(diào)了需要有針對性的策略來控制其傳播和抗生素抗性的發(fā)展。
Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen全自動生長曲線分析儀主要用于獲取不同抗生素濃度下不同銅綠假單胞菌分離株的生長曲線。首先將1.5μL過夜培養(yǎng)的菌液稀釋到998.5μL含有或不含抗生素的陽離子調(diào)整Mueller–Hinton肉湯（CAMHB）中，將稀釋后的樣本在37°C下使用Bioscreen全自動生長曲線分析儀主連續(xù)振蕩培養(yǎng)，并每5分鐘測量一次420-580nm波長下的光密度值，持續(xù)1300分鐘。每個實(shí)驗(yàn)設(shè)置進(jìn)行了三組生物學(xué)重復(fù)，每組生物學(xué)重復(fù)又進(jìn)行了三組技術(shù)重復(fù)。評估不同質(zhì)粒模式下銅綠假單胞菌在不同抗生素壓力下的生長適應(yīng)性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
研究結(jié)果表明，中國和美國的ST463菌株在blaKPC基因和質(zhì)粒攜帶方面存在顯著差異。在中國，幾乎所有ST463菌株都攜帶I型和/或II型質(zhì)粒（446/463），其中大部分還攜帶blaKPC基因（433/463）。相比之下，美國的ST463菌株中只有3株攜帶I型或II型質(zhì)粒，且沒有菌株攜帶blaKPC基因。這表明ST463可能起源于美國，隨后傳播到中國，在中國進(jìn)化出KPC質(zhì)粒，促使其在中國多個醫(yī)院迅速傳播。KPC相關(guān)質(zhì)粒在ST463-PA中的多階段進(jìn)化軌跡。在第一階段（2011—2012年），原始ST463菌株通過在原始pT1質(zhì)粒中整合blaKPC-2基因（形成模式A）或獲得pT2-KPC質(zhì)粒（形成模式B）來克服碳青霉烯類壓力。在第二階段（2012—2017年），由于pT1-KPC質(zhì)粒比pT2-KPC質(zhì)粒具有更高的適應(yīng)性，攜帶pT1-KPC質(zhì)粒的菌株（模式A）在ST463 CRPA中變得普遍。在第三階段（2017—2020年），pT1del-KPC質(zhì)粒（模式C）為ST463菌株提供了比pT1-KPC質(zhì)粒（模式A）更大的適應(yīng)性優(yōu)勢，從而取代了模式A，使ST463成為CRPA中的主要ST。攜帶pT1del-KPC質(zhì)粒的菌株在無抗生素或高濃度美羅培南條件下比攜帶pT1-KPC質(zhì)粒的菌株具有更高的適應(yīng)性。在低濃度美羅培南壓力下，pT1del-KPC質(zhì)粒通過增加質(zhì)?？截悢?shù)來放大blaKPC-2基因，而pT1-KPC質(zhì)粒則通過IS26介導(dǎo)的blaKPC-2基因擴(kuò)增來響應(yīng)。
圖1、本研究納入的106株ST463-PA分離株的基因組特征。a）ST463-PA分離株中I型質(zhì)粒覆蓋率（針對pS11-17進(jìn)行爆破）的分布（以紅點(diǎn)表示）;以及克隆ST463在CRPA分離株中的患病率（以藍(lán)線表示）。b）ST463-PA分離株的核心基因組系統(tǒng)發(fā)育樹。碳青霉烯酶類型、I型質(zhì)粒的存在、II型質(zhì)粒的存在和分離年份由內(nèi)而外表示。c）比較ST463-PA分離株中I型和II型質(zhì)粒的典型blaKPC-2遺傳背景?；疑幱氨硎鞠嗤男蛄?。d）來自ST463-PA分離株的質(zhì)粒重疊群比對顯示對pS11-17的覆蓋率降低。CDS編碼序列，CRPA碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌，TR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。
圖2、ST463-PA分離株中KPC相關(guān)質(zhì)粒的進(jìn)化過程。a在研究中，來自ST463-PA分離株的不同KPC相關(guān)質(zhì)粒模式的時間分布。每年的顯性和從屬質(zhì)粒模式分別以實(shí)線的不透明色和虛線的透明色為標(biāo)志。b關(guān)于ST463-PA分離株中KPC相關(guān)質(zhì)粒多階段進(jìn)化軌跡的提案。
圖3、本研究中使用的實(shí)驗(yàn)性ST463菌株的特征。實(shí)驗(yàn)菌株及其相應(yīng)的碳青霉烯類最低抑制濃度的示意圖如圖所示
圖4、實(shí)驗(yàn)性ST463菌株中與不同KPC相關(guān)質(zhì)粒相關(guān)的適應(yīng)性成本。測試了各種條件下的生長過程：a)無抗生素、b)8 mg/L亞胺培南、c)64 mg/L亞胺培南、d)1 mg/L美羅培南和e)8 mg/L美羅培南。面板中的每個數(shù)據(jù)點(diǎn)對應(yīng)于從三個技術(shù)重復(fù)（n=3個生物獨(dú)立樣本）計(jì)算出的一個生物重復(fù)。
圖5、不同碳青霉烯類壓力下的基因拷貝數(shù)變化。a-c）pT2-KPC、pT1-KPC和pT1del-KPC質(zhì)粒的基因拷貝數(shù)。d）pT1-KPC和pT1 del-KPC質(zhì)粒之間的比較。面板中的每個數(shù)據(jù)點(diǎn)對應(yīng)于從三個技術(shù)重復(fù)（n=3個生物獨(dú)立樣本）計(jì)算出的一個生物重復(fù)。
總結(jié)
產(chǎn)肺炎碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌（KPC-PA）分離株在國內(nèi)迅速擴(kuò)增，尤其是高?？寺T463。本研究旨在探索推動ST463克隆成功的KPC相關(guān)質(zhì)粒的進(jìn)化。對1258株臨床銅綠假單胞菌菌株的全基因組測序鑒定出106株ST463-PA分離株，KPC患病率為90.6%。早期（2011-2012），ST463-PA獲得了編碼KPC的II型（pT2-KPC）或I型質(zhì)粒（pT1-KPC）來克服碳青霉烯類應(yīng)激。2012年至2017年間，pT1-KPC質(zhì)粒因其較低的適應(yīng)性成本和IS26驅(qū)動的blaKPC擴(kuò)增能力而占主導(dǎo)地位。到2017-2020年，pT1-KPC中的大片段缺失形成了pT1del-KPC質(zhì)粒。它賦予了更低的適應(yīng)性成本、增強(qiáng)的blaKPC-2基因穩(wěn)定性和更大的拷貝數(shù)靈活性，同時保持了水平傳播能力。因此pT1 del-KPC質(zhì)粒最終成功，使ST463成為中國優(yōu)勢ST。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了推動ST463優(yōu)勢的進(jìn)化壓力，并強(qiáng)調(diào)需要有針對性的策略來控制其傳播和抗生素耐藥性的發(fā)展。通過Bioscreen C全自動生長曲線分析儀測量得到的生長曲線數(shù)據(jù)，研究人員能夠清晰地觀察到不同類型和狀態(tài)的KPC質(zhì)粒在銅綠假單胞菌中的生長動態(tài)。例如在沒有抗生素的情況下，攜帶特定質(zhì)粒模式的菌株可能生長緩慢，顯示出較高的適應(yīng)性成本。而在有抗生素壓力的條件下，某些質(zhì)粒模式的菌株能夠更好地生長，表明這些質(zhì)粒為菌株提供了對抗抗生素的適應(yīng)性優(yōu)勢。這些發(fā)現(xiàn)對于理解KPC質(zhì)粒在銅綠假單胞菌中的進(jìn)化和傳播具有重要意義，也有助于揭示質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變化如何影響菌株的生長和抗生素抗性。
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