2結(jié)果
2.1細(xì)胞接種
將處理好的53份貓眼、口、鼻拭子樣品接種F81細(xì)胞，共有33份樣品出現(xiàn)了CPE，細(xì)胞表現(xiàn)出聚集、圓縮、脫落、崩解等現(xiàn)象（圖1）。
2.2 FCV分離及鑒定及VP1基因同源性和遺傳進(jìn)化分析
2.2.1分離及鑒定將53份樣品的細(xì)胞上清液進(jìn)行FCVVP1基因PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)共有31份細(xì)胞上清出現(xiàn)2 010 bp左右目的條帶（圖2），與預(yù)期片段大小相符。53份樣品的FCV分離率為58.49%（31/53），其中寵物醫(yī)院樣品分離率為46.67%（14/30），貓舍樣品分離率為73.91%（17/23）。
2.2.2VP1基因同源性和遺傳進(jìn)化分析FCVVP1序列比對分析結(jié)果（表1）顯示：31株分離株間的核苷酸同源性為75.3%～99.8%，與國內(nèi)FCV疫苗株255的同源性為74.8%～78.3%，與國外FCV疫苗株F4的同源性為73.7%～78.6%，與跛行綜合征株2280的同源性為74.3%～79.0%，與2016年發(fā)現(xiàn)的美國超強(qiáng)毒株VS-FCV-Ari的同源性為73.9%～77.1%。同國際分離株相比，31株分離株與美國3786株的同源性較高，與美國超強(qiáng)毒株VS-FCV-Ari的同源性最低。與國內(nèi)分離株相比，與國內(nèi)吉林株CH-JL4的同源性最高，與湖北HB-S4株的同源性最低，與2014年上海SH2014株的同源性為75.9%～80.3%。相應(yīng)的氨基酸序列分析表明，31株分離株與255疫苗株的同源性為85.5%～89.1%，與F4疫苗株的同源性為83.1%～90.1%，與超強(qiáng)毒株VS-FCV-Ari的同源性為82.3%～86.8%，與上海SH2014株的同源性為83.7%～89.5%。FCVVP1基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果（圖3）顯示：31個(gè)分離株總體上可以劃分為3個(gè)分支。第一分支只包括FCV20-11和FCV20-29，其與疫苗株、超強(qiáng)毒株和國內(nèi)外的一些分離株親緣關(guān)系較近，形成一個(gè)獨(dú)立分支，進(jìn)化關(guān)系最為復(fù)雜，來源也最為廣泛；第二分支只包含14株分離株，遺傳進(jìn)化關(guān)系最為簡單，已經(jīng)形成獨(dú)立的遺傳進(jìn)化譜系；第三分支包括15株分離株及其他3株國內(nèi)毒株。結(jié)果表明，F(xiàn)CV進(jìn)化關(guān)系較為復(fù)雜，且本地分離株具有多樣性。
表1 31株FCV分離株與各參考毒株VP1基因同源性比較結(jié)果%
2.3 FHV-1分離、鑒定及gB基因同源性分析
2.3.1分離與鑒定將上述細(xì)胞上清液作為模板，進(jìn)行FHV-1gB基因PCR檢測，結(jié)果有2份細(xì)胞上清出現(xiàn)1 798 bp左右目的條帶（圖4），與預(yù)期片段大小相符，F(xiàn)HV-1的分離率為3.77%（2/53），2份樣品均來自于寵物醫(yī)院。
2.3.2gB基因同源性分析FHV-1gB基因序列比對分析結(jié)果（圖5）顯示，2株分離株間的核苷酸同源性為100%，與國內(nèi)株（GD2018、CHB）、美國經(jīng)典株（C-27）、澳大利亞株（Feligen）及其他參考株的同源性均為100%。
2.4 FIV鑒定
將53份尿囊液進(jìn)行HA檢測，結(jié)果均為陰性，未分離到病原。將其第3代尿囊液進(jìn)行HA通用RT-PCR檢測，結(jié)果也均為陰性。
3討論
近年來隨著人民生活水平的提高，貓作為伴侶動(dòng)物已逐漸成為城市生活的一部分。經(jīng)過初步統(tǒng)計(jì)，上海市家養(yǎng)寵物貓數(shù)量已達(dá)21萬只，流浪貓數(shù)量更是達(dá)到了27萬只。貓上呼吸道疾病在大量貓同居的環(huán)境中尤其嚴(yán)重，包括動(dòng)物收容所、貓舍和半野生動(dòng)物群落。FCV和FHV-1被認(rèn)為是引起貓上呼吸道疾病的主要病原，常引起鼻氣管炎、結(jié)膜炎和鼻/面部潰瘍等，雖然原發(fā)感染相對輕微，但繼發(fā)感染對幼貓或免疫功能低下的貓構(gòu)成較大威脅，并可能導(dǎo)致致命后果，而FIV可能會(huì)對家養(yǎng)伴侶動(dòng)物及人類健康帶來重大影響。
本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)和雞胚接種方法，對上海市秋冬季部分具有上呼吸道癥狀貓的眼、口、鼻拭子進(jìn)行FCV、FHV-1、FIV分離鑒定，發(fā)現(xiàn)FCV分離率為58.49%（31/53），其中貓舍樣品的分離率高達(dá)73.91%（17/23），推測主要原因是貓舍為群居場所，貓間接觸頻繁，容易造成相互傳染，因此貓的頻繁接觸和混居是FCV傳播和流行的重要因素。FHV-1分離率不高，僅為3.77%（2/53）。FHV-1是間歇排毒，并且大多數(shù)情況下潛伏在三叉神經(jīng)，所以病毒分離相對較為困難。2株分離株間的核苷酸同源性為100%，與其他參考株的同源性同樣均為100%。目前對FHV-1分離株的研究相對較少。國內(nèi)王吉等分離的5株FCV分離株的核苷酸與參考株同源性大于99%。同時(shí)有研究表明，F(xiàn)HV-1與其他水痘病毒的gB基因具有高度相似性。gB蛋白作為免疫原性蛋白，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中究竟如何影響FHV-1感染宿主及其在宿主體內(nèi)的增殖仍需進(jìn)一步研究證明。31份FCV陽性樣本中未同時(shí)分離得到FHV-1。雖然兩種病毒都能感染F81細(xì)胞，但是兩者的CPE和生長曲線并不一致，可能導(dǎo)致兩者不能同時(shí)被分離到。采用雞胚接種方法未分離到FIV，可能是臨床貓F(tuán)IV感染率較低，也可能與FIV的一過性感染特性有關(guān)，或者是該病毒培養(yǎng)方法并不適用FIV分離，具體原因有待進(jìn)一步研究。本研究采集臨床中具有呼吸道疾病癥狀貓的口鼻拭子樣本進(jìn)行檢測，所得結(jié)果為病毒核酸檢出率，不能代表貓的實(shí)際感染情況。
FCV雖然只有1個(gè)血清型，但抗原很容易變異。目前針對FCV感染無特效藥，疫苗是控制該病的重要手段。在分離到FCV的31份臨床病例中，70.97%（22/31）的病例都免疫了進(jìn)口“妙三多”（FPV、FCV和FHV-1）疫苗，但仍然感染FCV并導(dǎo)致發(fā)病，說明目前的貓三聯(lián)疫苗并不能保護(hù)機(jī)體抵御所有FCV毒株的感染，因此疫苗保護(hù)率差是造成FCV感染的因素之一。國內(nèi)同樣有研究顯示，該疫苗對FCV保護(hù)力不佳。有研究表明，使用滅活的FCV顆粒進(jìn)行鼻內(nèi)免疫可對貓的同源和異源病毒提供強(qiáng)有力的保護(hù)。通過反向遺傳技術(shù)也使FCV疫苗研究取得了一定進(jìn)展。本研究中，F(xiàn)CV分離株間的核苷酸同源性為75.3%～99.8%，與FCV疫苗株255和F4的同源性都不高，與美國超強(qiáng)毒株VS-FCV-Ari的同源性只有73.9%～77.1%。國內(nèi)相關(guān)研究同樣表明，F(xiàn)CV感染比較普遍，且毒株相互間的同源性不高，來源復(fù)雜。因而，今后有必要繼續(xù)進(jìn)行FCV等病毒的流行情況調(diào)查。
綜上所述，本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)分離獲得了31株FCV分離株和2株FHV-1分離株，并進(jìn)行了基因序列分析，初步了解了上海市貓上呼吸道疾病病例中FCV、FHV-1和FIV的感染比例以及病原的遺傳變化特點(diǎn)，為貓呼吸道病毒性疾病診斷試劑及疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。
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