1.2方法
1.2.1菌種活化
取-80℃保存的水稻黃單胞菌，使用接種環(huán)蘸取菌液在NA平板上劃線，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2~3 d，隨后挑取單菌落接種于5 mL NB培養(yǎng)基中，30℃、180 r min-1培養(yǎng)24 h。
1.2.2噬菌體分離與純化
將水樣在5000×g下離心10 min，使用抽濾泵和0.45μm濾膜對上清液進行過濾，在濾液中添加MgSO4至終濃度為50 mmol L-1，靜置10 min后使用0.22μm濾膜抽濾。收集0.22μm濾膜放入100 mL洗脫液(3%吐溫80，3%牛肉膏，5 mmol L-1 NaCl)中，超聲20 min后過濾除菌，所得濾液即為噬菌體原液。
吸取100μL水稻黃單胞菌與100μL上述噬菌體原液加入到5 mL NB培養(yǎng)基中，30℃、180 r min-1培養(yǎng)24 h，過濾除菌后得到擴培液。重復此擴培過程3次。取100μL菌液加入5 mL NB(0.4%瓊脂，2 mmol L-1 CaCl2)培養(yǎng)基中，倒入NA固體平板中，待其凝固后，使用擴培液點樣，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱24 h，觀察有無噬菌斑形成。使用雙層板法純化噬菌體，挑選單個噬菌斑到5 mL NB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心，取上清液過濾，濾液適當稀釋后重復上述操作6~7輪，直至得到大小和形態(tài)一致的噬菌斑。得到的噬菌體純化液可置于4℃?zhèn)溆茫⒓尤虢K濃度為30%的甘油于-80℃保藏。
1.2.3形態(tài)觀察
采用CsCl密度梯度離心法純化噬菌體濃縮液，依次將2.5 mL 1.3 g mL-1、2.5 mL 1.5 g mL-1、2.5 mL 1.7 g mL-1濃度的CsCl及噬菌體濃縮液加入到10 mL貝克曼離心管中。使用SW 41 Ti轉(zhuǎn)子(Optima XPN-100 ultracentrifuge，Beckman Coulter，美國)，200，600×g、4℃離心3 h，在1.3 g mL-1和1.5 g mL-1 CsCl之間形成藍白色條帶，用注射器收集此處的噬菌體顆粒，經(jīng)磷鎢酸(2%)染色法染色后使用透射電鏡(TEM，Hitachi H-7650)觀察噬菌體形態(tài)。
1.2.4噬菌體效價的測定
使用SM buffer對噬菌體擴培液進行10倍倍比梯度稀釋，分別取最后的3個稀釋梯度各100μL噬菌體與100μL宿主菌混勻后加入到5 mL培養(yǎng)基(0.4%瓊脂，2 mmol L-1 CaCl2)中，混勻后傾倒在固體平板上，待瓊脂凝固后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)一段時間后對平板上的噬菌斑進行計數(shù)，每個處理重復3次。噬菌體效價(Phage titer，pfu mL-1)=平均噬菌斑個數(shù)×噬菌體稀釋倍數(shù)×10。
1.2.5宿主譜測定
通過雙層平板點樣法鑒定宿主譜。將噬菌體效價分別稀釋為1×1010~1×106 pfu mL-1 5個梯度。將100μL菌液加入到含0.4%瓊脂的5 mL NB培養(yǎng)基中，混勻倒于NA平板上，吸取5個梯度的2μL噬菌體培養(yǎng)液分別滴至平板，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察有無噬菌斑出現(xiàn)。
1.2.6噬菌體測序及基因組分析
使用苯酚—氯仿法提取噬菌體DNA。通過Illumina Miseq測序平臺對提取的噬菌體DNA進行測序，通過SPAdes v.3.12.2拼接組裝，獲得噬菌體的全基因組序列。將噬菌體的全基因組序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTn進行比對，使用ANIm進行核苷酸序列相似性計算。通過Prokka對噬菌體基因組信息進行注釋。利用在線網(wǎng)站對基因組進行可視化分析。分別利用耐藥性基因數(shù)據(jù)庫、毒力因子數(shù)據(jù)庫、tRNA Scan-SE在線網(wǎng)站分析噬菌體是否含有耐藥基因、毒力基因及tRNA基因。
1.2.7蛋白網(wǎng)絡圖分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
為進一步確定噬菌體的親緣關系，對其進行蛋白網(wǎng)絡圖分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。采用vConTACT 2.0、Cytoscape 3.7.2繪制噬菌體蛋白網(wǎng)絡圖。系統(tǒng)發(fā)育樹選取保守性較強的末端酶大亞基蛋白(TerL)基因作為標志基因，用FastTree構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.2.8最佳感染復數(shù)測定
噬菌體感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)是指噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值。參考前人的文獻并進行了一些修改，將噬菌體稀釋成1×1010~1×104 pfu mL-1，將宿主菌用SM buffer調(diào)整至1×108 cfu mL-1。根據(jù)不同MOI(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001)分別取100μL對應效價的噬菌體液和100μL宿主菌加入5 mL NB(2 mmol L-1 CaCl2)中，30℃、180 r min-1共培養(yǎng)24 h，離心去除細菌沉淀，取上清使用雙層平板法測定效價。試驗重復3次，測得效價最高的MOI為最佳MOI。
1.2.9一步生長曲線測定
一步生長曲線反映了噬菌體復制過程中數(shù)量的動態(tài)變化，是衡量噬菌體裂解能力的一個重要指標。按照MOI=0.1分別取100μL 1×107 pfu mL-1噬菌體和100μL 1×108 cfu mL-1宿主菌與800μL SM Buffer(含2 mmol L-1 CaCl2)混勻，30℃靜置30 min后8000×g離心2 min，使用0.45μm濾頭過濾，取上清液計算未吸附的噬菌體數(shù)量。同時用1 mL SM Buffer重懸沉淀，取100μL重懸液加入9.9 mL NB(含2 mmol L-1 CaCl2)培養(yǎng)基中混勻，取適量混合液過濾，記為1 h，測定噬菌體效價。將剩余混合液在30℃、180 r min-1條件下培養(yǎng)，每隔1 h取一次樣，直至12 h。將濾液進行適當稀釋，通過雙層平板法測定不同時間點的噬菌體效價。噬菌體爆發(fā)量(pfu cell-1)=噬菌體爆發(fā)量平穩(wěn)期平均爆發(fā)量/吸附進入宿主菌的噬菌體數(shù)。
1.2.10噬菌體耐受性測定
研究噬菌體的耐受性主要是測定噬菌體對溫度、pH和紫外線的耐受性。溫度耐受性試驗參考Zhang等的方法，把噬菌體效價調(diào)整為1×108 pfu mL-1，取1 mL噬菌體液放置于不同的溫度(4、20、30、37、40、50、60、70、80℃)下水浴1 h，測定噬菌體的效價。噬菌體pH耐受性試驗參考Kumar等的研究，利用1 mol L-1的氫氧化鈉和鹽酸將NB液體培養(yǎng)基調(diào)成不同的pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)。將100μL噬菌體(1×109 pfu mL-1)分別加入到900μL不同pH的NB溶液中，37℃溫浴1 h，測定噬菌體的效價。對于紫外耐受的測定，根據(jù)前人做一定修改，將10 mL噬菌體(1×108 pfu mL-1)加入無菌培養(yǎng)皿中。并在生物安全柜內(nèi)將培養(yǎng)皿放于紫外燈(254 nm，25 W)下方15 cm，照射30 min，每隔5 min取一次樣，最后測定所有樣品效價。以上試驗全部重復3次。
1.2.11噬菌體抑制黃單胞菌試驗
通過監(jiān)測細菌OD600的變化，評估噬菌體對黃單胞宿主菌Xoo 2068的抑制作用。將噬菌體效價稀釋為1×1010~1×104 pfu mL-1，將宿主菌稀釋為1×108 cfu mL-1。根據(jù)不同MOI(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001)分別取100μL噬菌體和宿主菌加入96孔板中混合均勻，對照組用SM buffer代替噬菌體。將96孔板放入預熱好的30°C酶標儀中，測定OD600的值，記為0 min。每6 h測量一次，持續(xù)48 h，試驗重復3次。
1.2.12數(shù)據(jù)分析
采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后檢驗進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示有顯著性差異。利用軟件GraphPad Prism 8.0繪圖。
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