摘要
鼠疫耶爾森菌作為假結核耶爾森菌的一個克隆變體進化而來，通過跳蚤傳播的、生物膜介導的方式引發(fā)腺鼠疫。LysR型轉錄調節(jié)因子RovM僅在鼠疫耶爾森菌感染跳蚤宿主期間被高度誘導。RovM在其他病原體中的同源物調節(jié)生物膜形成、營養(yǎng)感應和毒力；包括在假結核耶爾森菌中，RovM抑制主要毒力因子RovA。本研究通過使用缺失rovM的鼠疫耶爾森菌KIM6+菌株（ΔrovM）來調查RovM在跳蚤感染期間的作用。ΔrovM突變株在跳蚤單一感染中，其特有的生物膜腸道阻塞、生長或存活未受影響。
然而，在跳蚤共感染期間，與野生型菌株相比，ΔrovM突變株表現(xiàn)出顯著的競爭適應性缺陷。這種競爭適應性缺陷在反式互補并過表達rovM的ΔrovM突變株中，相對于野生型恢復為適應性優(yōu)勢。與此一致的是，與野生型相比，產生更高RovM轉錄水平的鼠疫耶爾森菌菌株在響應特定營養(yǎng)物質時表現(xiàn)出更高的生長速率和差異化的生物膜形成能力。此外，我們證明在跳蚤體內rovA并未被RovM抑制，但在體外，rovM轉錄水平升高與特定營養(yǎng)條件下rovA的抑制相關?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明RovM很可能感知跳蚤腸道環(huán)境中的特定營養(yǎng)線索，并相應地指導代謝適應以增強鼠疫耶爾森菌對跳蚤腸道的定植。
引言
引起腺鼠疫的桿菌——鼠疫耶爾森菌，可以通過在其跳蚤媒介的前胃形成堅固的生物膜而有效地傳播給哺乳動物宿主。為了理解指導跳蚤體內生物膜阻塞的分子機制，先前已經(jīng)對來自阻塞跳蚤的鼠疫耶爾森菌與在溫度匹配的體外培養(yǎng)條件下生長的鼠疫耶爾森菌的轉錄反應進行了表征。觀察到編碼LysR型轉錄調節(jié)因子（LTTR）的rovM基因僅在跳蚤腸道中被高度上調。
LTTRs在原核生物中構成一個龐大的家族，調節(jié)涉及毒力、代謝、運動和群體感應的多種基因。鼠疫耶爾森菌的RovM蛋白與同源LTTRs（LrhA/HexS/PecT/HexA）共享超過65%的整體同一性，這些同源物在致病性大腸桿菌、沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬以及昆蟲病原體發(fā)光光桿菌和嗜線蟲致病桿菌中調節(jié)生物膜形成、粘附素合成、胞外多糖、運動性、胞外酶和胞外脂質等基本毒力因子。然而，與昆蟲病原體發(fā)光光桿菌和嗜線蟲致病桿菌不同，鼠疫耶爾森菌對跳蚤無毒力。
Heroven等人確定，假結核耶爾森菌的RovM轉錄調節(jié)因子響應特定的環(huán)境營養(yǎng)線索，是一個關鍵的毒力調節(jié)因子，其蛋白水平升高會導致小鼠感染期間運動過度且無法傳播到更深層組織。重要的是，假結核耶爾森菌的RovM能夠調節(jié)rovA的活性，rovA編碼另一個主要的毒力轉錄調節(jié)因子，間接控制腸道組織中的細胞侵襲。RovM蛋白能夠在基本培養(yǎng)基中抑制rovA，這是通過全局代謝調節(jié)蛋白CsrA及其相關的調節(jié)性非編碼RNA介導的?？偟膩碚f，RovA在調節(jié)毒力方面的作用已在假結核耶爾森菌、小腸結腸炎耶爾森菌和鼠疫耶爾森菌中得到明確界定。特別是在鼠疫耶爾森菌中，已證明RovA激活pH6抗原位點（psaEFABC），該位點負責合成和運輸PsaA菌毛，以增強對巨噬細胞吞噬的抵抗力；并且RovA和PsaA在鼠疫腺鼠疫小鼠模型中都是完全毒力所必需的。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，rovM在跳蚤體內的上調伴隨著rovA和psaE的顯著下調。相反，在腺鼠疫期間，rovA上調超過5倍，而rovM下調。
鑒于RovM及其同源物在細菌致病性中的重要性，我們預測鼠疫耶爾森菌的RovM在調節(jié)生物膜形成、抑制rovA和/或其哺乳動物毒力調節(jié)子、和/或營養(yǎng)感應以增強鼠疫耶爾森菌對跳蚤宿主的感染方面具有保守作用。為了驗證這一點，我們構建了鼠疫耶爾森菌KIM6+ΔrovM突變體，并在體外通過評估其生長、生物膜形成以及rovM和rovA轉錄的測定，以及在跳蚤腸道感染期間體內評估其生物膜介導的腸道阻塞和存活能力來表征其作用。我們的結果表明，轉錄調節(jié)因子RovM可以響應特定的營養(yǎng)線索（例如精氨酸）調節(jié)生物膜，但并不控制跳蚤腸道中rovA的表達。重要的是，RovM的表達似乎與營養(yǎng)感應和獲取相關，并且對于鼠疫耶爾森菌有效適應跳蚤腸道環(huán)境至關重要。
材料與方法
細菌菌株、培養(yǎng)基和生長條件
本研究中使用的細菌菌株是鼠疫耶爾森菌KIM6+，該菌株缺乏編碼T3SS的70-kb毒力質粒。所有生長研究均在約23°C下使用Bioscreen C搖床培養(yǎng)箱進行，并在所選研究培養(yǎng)基中進行連續(xù)的條件化生長步驟。在本研究中，除了豐富的復雜LB培養(yǎng)基外，還使用了兩種用于鼠疫耶爾森菌特定培養(yǎng)的化學限定培養(yǎng)基。一種是稱為TMH的復雜限定培養(yǎng)基，另一種是最低培養(yǎng)基，我們稱之為Sebbane最低培養(yǎng)基（SMM）。這兩種鼠疫耶爾森菌限定培養(yǎng)基都用作基礎培養(yǎng)基，可以向其中添加新的碳源或氮源。TMH培養(yǎng)基促進鼠疫耶爾森菌的生物膜形成，并補充有0.2%半乳糖和1μg/mL血紅素。也使用了不含精氨酸（arg）的TMH培養(yǎng)基。為簡化參考，我們將補充了0.2%半乳糖和1μg/mL血紅素、含或不含arg的TMH培養(yǎng)基分別稱為TMH-gal+或TMH-gal+arg。
SMM培養(yǎng)基包含鼠疫耶爾森菌生長所需的基本代謝物，包括其營養(yǎng)缺陷的五種氨基酸（異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸）。對于生長研究以確定新營養(yǎng)物質對鼠疫耶爾森菌生長的影響，將SMM培養(yǎng)基補充以濃度為0.2%（w/v）的糖類：葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖和N,N'-二乙酰殼二糖。或者，將SMM中通常不含的氨基酸：谷氨酰胺（gln）、精氨酸（arg）和組氨酸（his），按照它們在TMH培養(yǎng)基中的濃度（分別為100mM、24mM和2mM）補充到SMM中。生長研究進行了3-4次獨立的生物學重復。生長速率使用指數(shù)生長期的線性回歸分析計算。
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