結(jié)果
不同核酸提取方法對(duì)土壤原核生物多度與多樣性的影響
與總DNA提取相比，DNase預(yù)消化和PMA處理均顯著降低了土壤原核生物豐度，而堿性緩沖液洗滌和rRNA直接表征則沒有觀察到顯著差異（圖1A）。核酸提取方法對(duì)土壤原核生物豐富度和香農(nóng)指數(shù)的分析也有顯著影響（圖1B、C）。
具體而言，與總DNA提取相比，DNase預(yù)消化導(dǎo)致原核生物豐富度顯著下降了5.6%，而rRNA直接表征平均提高7.6%的擴(kuò)增子序列變異（ASV）數(shù)（圖1B）。盡管如此，與總DNA提取相比，堿性緩沖液洗滌和PMA處理未對(duì)原核生物豐富度產(chǎn)生顯著影響（圖1B）。不同核酸提取方法所表征的原核生物香農(nóng)指數(shù)與豐富度的響應(yīng)相似，但靈敏度更高（圖1C）。除了總原核生物和活體原核生物之間的區(qū)別之外，在各個(gè)胞內(nèi)核酸提取方法間，也觀察到了活體原核生物多度和多樣性的顯著差異（圖1A-C）。
圖1.不同核酸提取方法對(duì)土壤原核生物16S rRNA基因拷貝數(shù)、豐富度和香農(nóng)指數(shù)的影響（A）16S rRNA基因拷貝數(shù)/克土壤（log10）；（B）原核生物物種豐富度（103）；（C）原核生物香農(nóng)指數(shù)。Total：總DNA提??；DNase：DNase預(yù)消化；ABW：堿性緩沖液洗滌；PMA：疊氮溴化丙錠（PMA）處理；rRNA：rRNA直接表征。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
不同方法所表征土壤原核生物群落結(jié)構(gòu)的差異
五種核酸提取方法共檢測(cè)到62,939個(gè)共有ASV（占全部ASV的67.8%），共有ASV的平均相對(duì)多度為97.6%（圖S1）。然而，不同方法所表征的多個(gè)原核生物類群的相對(duì)多度表現(xiàn)出顯著差異（表S1；圖2A–F及S2–6）。例如，與堿性緩沖液洗滌相比，DNase預(yù)消化顯著降低了放線菌門的相對(duì)多度（圖2A）。進(jìn)一步分析表明，總體與活體原核生物的群落結(jié)構(gòu)相似性僅約50%，其中堿性緩沖液洗滌法的相似性最高，而rRNA直接表征最低（圖S5）。
此外，活體原核生物群落間的結(jié)構(gòu)相似性為47.8%~66.2%（圖S5）?？傮w與活體原核生物群落的相似性與多個(gè)環(huán)境因子顯著相關(guān)，但其相關(guān)性的強(qiáng)度和性質(zhì)因方法而異（圖S7）。具體而言，基于DNase預(yù)消化法與總DNA提取所表征群落結(jié)構(gòu)的相似性與土壤水分、總磷、總氮、總有機(jī)碳及黏粒含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而與砂粒含量呈正相關(guān)（圖S7）；rRNA直接表征與總DNA提取所表征群落結(jié)構(gòu)的相似性與土壤總磷、總鉀及總有機(jī)碳含量呈正相關(guān)，而堿性緩沖液洗滌和PMA處理所表征群落結(jié)構(gòu)的相似性與環(huán)境因子相關(guān)性較弱（圖S7）。
圖2.不同土壤活體微生物研究方法所表征土壤原核生物類群的相對(duì)多度差異（A）DNase與ABW的比較；（B）DNase與PMA的比較；（C）DNase與rRNA的比較；（D）ABW與PMA的比較；（E）ABW與rRNA的比較；（F）PMA與rRNA的比較。
統(tǒng)計(jì)比較的詳細(xì)說明見表S1。DNase：DNase預(yù)消化；ABW：堿性緩沖液洗滌；PMA：疊氮溴化丙錠（PMA）處理；rRNA：rRNA直接表征。紅色節(jié)點(diǎn)表示前者相對(duì)多度明顯高于后者的類群，綠色節(jié)點(diǎn)表示前者相對(duì)多度明顯低于后者的類群。僅顯示差異顯著的原核生物類群。從內(nèi)到外的環(huán)代表原核生物從界到屬的分類級(jí)別。
不同方法所表征的土壤原核生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)
不同方法所表征的土壤原核生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度具有顯著差異（圖3A–E）。去除胞外DNA干擾后，網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度顯著降低：負(fù)連接數(shù)減少85.3%~98.5%，網(wǎng)絡(luò)連通性下降15.6%~63.7%（表S2；圖3A–E），但模塊化程度提升了9.9%~47.8%（表S2）。總原核生物群落的網(wǎng)絡(luò)魯棒性顯著低于活體原核生物（圖3F），其魯棒性排序?yàn)椋簉RNA直接表征>堿性緩沖液洗滌>PMA處理>DNase預(yù)消化>總DNA提?。▓D3F）。不同方法的網(wǎng)絡(luò)模塊中心節(jié)點(diǎn)（Module hubs）數(shù)量與組成差異顯著，基于rRNA直接表征的網(wǎng)絡(luò)模塊中心點(diǎn)數(shù)量顯著高于其他方法（圖3A–E），且活體原核生物網(wǎng)絡(luò)中41.7%~72.7%的模塊中心點(diǎn)發(fā)生了更替（圖S8）。
圖3.基于不同核酸提取方法所表征的土壤原核生物共現(xiàn)模式（A–E）
基于不同核酸提取方法的土壤原核生物群落共現(xiàn)模式；（F）基于不同核酸提取方法的網(wǎng)絡(luò)魯棒性。根據(jù)分類信息對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了著色，文本中的節(jié)點(diǎn)代表模塊中心點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)的魯棒性是根據(jù)從網(wǎng)絡(luò)中移除的節(jié)點(diǎn)比例所引起自然連通性的變化來評(píng)估的，自然連通性的下降率越高，表明網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性越低。Total：總DNA提取；DNase：DNase預(yù)消化；ABW：堿性緩沖液洗滌；PMA：疊氮溴化丙錠（PMA）處理；rRNA：rRNA直接表征。
不同方法所表征土壤原核群落構(gòu)建機(jī)制的一致性
不同方法解析的原核生物群落結(jié)構(gòu)與地理距離或環(huán)境因素有的關(guān)系十分相似（圖4A和S9）。具體而言，隨著地理距離的增加，原核生物群落結(jié)構(gòu)的相似性顯著下降（圖4A）。
最主要區(qū)別是，基于rRNA直接表征的原核生物群落結(jié)構(gòu)相似性的衰減速率遠(yuǎn)低于其他方法（圖4A）。同樣，不同核酸提取方法所表征的原核生物群落結(jié)構(gòu)一般與年均溫（MAT）、年均降雨量（MAP）、海拔、pH值、總氮（TN）和粉粒含量（圖S9和表S3）顯示出顯著和相似的相關(guān)性。為進(jìn)一步揭示環(huán)境因素對(duì)不同方法所表征原核生物群落結(jié)構(gòu)的直接和間接影響，我們進(jìn)行了結(jié)構(gòu)方程模型分析。結(jié)果表明，地理位置、氣候變量、土壤性質(zhì)和質(zhì)地共同解釋了原核生物群落結(jié)構(gòu)的大部分變異，
不同方法的解釋方差略有不同：DNase預(yù)消化（74%）、堿性緩沖液洗滌（72%）、PMA處理（69%）、總DNA（69%）和rRNA直接表征（50%）（圖S10）。此外，不同方法所揭示的群落構(gòu)建機(jī)制高度一致（圖4A–D）。修正隨機(jī)比（MST）分析表明，隨機(jī)過程和確定性過程在決定土壤原核生物群落構(gòu)建方面幾乎同等重要（圖4B）。系統(tǒng)發(fā)生學(xué)（iCAMP）分析表明，同質(zhì)性選擇（HoS）、擴(kuò)散限制（DL）和漂變是驅(qū)動(dòng)土壤原核生物群落構(gòu)建的主要過程，其貢獻(xiàn)率分別為38.36%~43.5%、28.8%~31.1%和20.38%~24.04%（圖4C）。相反，異質(zhì)選擇（HeS）和同質(zhì)擴(kuò)散（HD）的貢獻(xiàn)幾乎可以忽略不計(jì)（圖4C）。中性模型（NCM）可解釋原核生物群落結(jié)構(gòu)中約75%的變異，且不同核酸提取方法所表征原核生物群落的Nm值相似（圖4D）。
圖4.基于不同方法的原核生物群落相似性距離衰減模式和構(gòu)建機(jī)制（A）距離衰減關(guān)系；（B）基于修正隨機(jī)比（MST）的群落構(gòu)建機(jī)制；（C）基于iCAMP的群落構(gòu)建機(jī)制；以及（D）中性群落模型（NCM）的適合度。HoS：同質(zhì)選擇；HeS：異質(zhì)選擇；HD：同質(zhì)擴(kuò)散；DL：擴(kuò)散限制；Total：總DNA提?。籇Nase：DNase預(yù)消化；ABW：堿性緩沖液洗滌；PMA：疊氮溴化丙錠（PMA）處理；rRNA：rRNA直接表征。
相關(guān)新聞推薦
1、一步生長(zhǎng)曲線可以說明什么的生長(zhǎng)規(guī)律？一步生長(zhǎng)曲線各期特點(diǎn)
2、不同pH、Na2CO3、NaCl濃度對(duì)耐鹽堿菌株NM-1生長(zhǎng)曲線的影響——實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
3、低pH對(duì)釀酒酵母酒精發(fā)酵的影響及酵母應(yīng)答酸脅迫機(jī)制初探