為此，他們優(yōu)化了一個(gè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了一個(gè)BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因baiG以增加BA吸收，并刪除了內(nèi)源性7α-HSDH基因以避免干擾。通過(guò)從統(tǒng)一的人類和哺乳動(dòng)物胃腸道蛋白質(zhì)目錄（UHGP/UMGP）中篩選候選HSDH基因，并使用EFI-EST工具構(gòu)建序列相似性網(wǎng)絡(luò)，最終選擇了207個(gè)候選基因進(jìn)行表達(dá)。在初步篩選中，發(fā)現(xiàn)其中74個(gè)基因表現(xiàn)出BA HSDH活性。通過(guò)向含有功能性HSDH基因的大腸桿菌文庫(kù)中添加46種BA標(biāo)準(zhǔn)品并使用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）監(jiān)測(cè)其轉(zhuǎn)化過(guò)程，確定了新形成的膽汁酸相關(guān)質(zhì)譜峰是否為先前未充分表征的膽汁酸，并基于其代謝功能和底物特異性分配其身份。
2.腸道菌群編碼未被充分表征的膽汁酸羥基類固醇脫氫酶，這些酶可產(chǎn)生較少被研究的膽汁酸異構(gòu)體
接著研究人員通過(guò)對(duì)74個(gè)HSDH基因（其中59個(gè)為首次報(bào)道）的功能篩選，鑒定了56種此前未被充分描述的膽汁酸異構(gòu)體，并通過(guò)核磁共振（NMR）驗(yàn)證了這些化合物的身份及相應(yīng)HSDH的氧化還原功能。研究發(fā)現(xiàn)，盡管這些HSDH具有相似的催化功能，但其蛋白質(zhì)序列多樣性顯著，例如Enterocloster clostridioformisATCC 25537中的3α-HSDH（MBHC01/XMLSchema）與Bacteroidales bacterium22bG中的另一個(gè)3α-HSDH（MBHC043）僅有19%的序列相似度。此外，HSDH基因能夠代謝廣泛的膽汁酸底物，轉(zhuǎn)化效率從2%到超過(guò)90%不等，顯示出對(duì)不同位置和方向羥基的選擇性。這些HSDH廣泛分布于人類腸道細(xì)菌中，超過(guò)40%的人類腸道細(xì)菌物種至少攜帶一個(gè)與HSDH同源的基因。進(jìn)一步分析顯示，這些未充分表征的BA異構(gòu)體在哺乳動(dòng)物糞便樣本中普遍存在，如3-oxo-NorCA和12-oxo-isoCA，濃度范圍為0.1至5 mM，在所有脊椎動(dòng)物哺乳類中均檢測(cè)到。某些膽汁酸如3-oxoα-MCA和3-oxoβ-MCA則特異性存在于嚙齒類動(dòng)物中。研究結(jié)果表明，每種哺乳動(dòng)物物種都有獨(dú)特的BA指紋景觀。
3.膽汁酸可拮抗人類雄激素受體
為了進(jìn)一步鑒定以前未知的BA介導(dǎo)的宿主信號(hào)通路和生物學(xué)，研究通過(guò)細(xì)胞基礎(chǔ)的熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，篩選了56種未充分表征的BAs，并發(fā)現(xiàn)其中3-oxo-D5-LCA是一種有效的hAR拮抗劑，IC50值為119.4 nM（或443 nM，使用15 pM二氫睪酮[DHT]作為激動(dòng)劑）。此外，其他幾種已知BAs如3-oxo-D4-LCA和3-oxo-D4,6-LCA也表現(xiàn)出顯著的AR拮抗活性，IC50值分別為133.6 nM和99.7 nM（同樣以15 pM DHT作為激動(dòng)劑）。這些BA通過(guò)平面化的A/B環(huán)與AR配體結(jié)合域（AR-LBD）中的Trp741相互作用，并通過(guò)C3羰基和C24羧基形成氫鍵，進(jìn)一步穩(wěn)定結(jié)合。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)支持了這一觀察結(jié)果。更重要的是，這些BA不僅抑制AR依賴基因（如PSA、KLK2和TMPRSS2）的表達(dá)，還在LNCaP和C4-2前列腺癌細(xì)胞系中有效抑制了細(xì)胞增殖，其效果可與臨床使用的AR拮抗劑enzalutamide媲美。此外，這些BA還能夠抑制DHT誘導(dǎo)的AR核轉(zhuǎn)位，表明其拮抗活性部分源于阻止AR進(jìn)入細(xì)胞核。
4.拮抗雄激素受體的膽汁酸來(lái)源于微生物群，與人類相關(guān)
本研究通過(guò)多方面證據(jù)證實(shí)，拮抗雄激素受體（AR）的膽汁酸（BAs）由腸道微生物群依賴性途徑生成，并在人體中具有生理相關(guān)性。首先，多種人類腸道共生菌（如Parabacteroidessp.D13和C.mitsuokai）在體外能夠高效生成這些BA代謝物，且在定植于無(wú)菌小鼠模型中時(shí)也能產(chǎn)生顯著水平的3-oxo-D4-LCA。其次，宏基因組分析顯示，參與合成這些AR拮抗性BAs的關(guān)鍵基因（如5β-還原酶和3α/3β-HSDH基因）在健康人群中廣泛存在，盡管其相對(duì)豐度在不同個(gè)體間存在顯著差異。最后，代謝組學(xué)分析表明，這些BAs在人體糞便中的濃度范圍可達(dá)0–925μM，在血清中也可達(dá)0–250 nM，顯示出其在人體內(nèi)的普遍存在性和濃度變異性。這些結(jié)果共同支持了腸道微生物在調(diào)節(jié)宿主激素信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用。
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