1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株、質粒和引物本研究用到的菌株、質粒和引物分別見表1和表2。大腸桿菌DH5α用于質粒載體的構建和擴增,并用作lac Z基因的供體;酵母菌株W303-1A和An-a用作親本菌株,酵母菌株WC用作特定核酸序列片段的供體。菌株WC在前期工作中從菌株W303-1A構建,其染色體LEU2基因ORF內第443到第445位的三個堿基被刪除,同時代替插入了片段UPRE-mCherry。此片段全長1 215bp,含有如下元件:Sal I酶切位點;26bp未折疊蛋白質應答元件(unfolded protein response element,UPRE)堿基序列5'-AGGAACTGGACAGCGTGTCGAAAAAG-3';CYC1基因起始密碼子上游250bp序列(簡稱Pcyc1);711bp mCherry ORF序列;216bp ADH I基因終止子序列(簡稱TadhI);BamH I酶切位點。當將此片段中基因mCherry替換為lac Z時,片段名稱相應變?yōu)閁PRE-lac Z。
表1實驗所用菌株和質粒
表2實驗所用引物
1.1.2培養(yǎng)基和生長條件大腸桿菌用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:(1)Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(g/L):酵母抽提物5,胰化蛋白胨10,NaCl 10,pH 7.0,固體培養(yǎng)基則還需添加瓊脂粉15,用于轉化子篩選時添加氨芐青霉素至終濃度100mg/L(簡稱為LB+Ap100平板);(2)培養(yǎng)條件:固體為37℃培養(yǎng)箱倒置;液體為37℃、240r/min。
酵母用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:培養(yǎng)基有:(1)YPD培養(yǎng)基、CMG完全基本培養(yǎng)基、篩選用培養(yǎng)基CMG-URA、CMG-URA+HyB和反選用5'-乳清酸(簡稱5'-FOA)平板,均參見陸海燕等人文獻[20],HyB為潮霉素B的簡稱;(2)YPC培養(yǎng)基:碳源為纖維二糖,余同YPD;(3)衣霉素誘導劑顯色篩選平板YPD+Tm+X-Gal:在YPD固體培養(yǎng)基中添加衣霉素(tunicamycin,Tm),使其終濃度為1μg/ml;添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal),使其終濃度為40μg/ml。培養(yǎng)條件:固體為30℃培養(yǎng)箱倒置;液體為30℃、220r/min。
1.1.3主要試劑和儀器主要試劑:鮭魚精DNA購自美國Clontech公司,LiAC、PEG4000購自美國Sigma公司,內切酶、DNA Marker、Taq等工具酶購自大連Takara公司,其余實驗所需試劑均購自上海生工技術有限公司。瓊脂糖凝膠片段回收試劑盒以及質粒抽提試劑盒購自美國Omega公司。無縫重組試劑盒購自諾唯贊公司。引物合成及序列測定由北京奧科生物技術公司完成。主要儀器有:紫外分光光度計(美國Unico公司),PCR儀(德國Biometra公司),恒溫培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)。
1.2質粒構建
以pRS42H-gRNA為出發(fā)材料構建得到pRS42H-gLEU2(見表1)的流程,概述如下:(1)制備pRS42H-gRNA PCR產(chǎn)物:以質粒pRS42H-gRNA的Not I酶切線性化片段為PCR擴增模板,使用引物對P1和P2(見表2)進行擴增,反應條件為:95℃5min,94℃30sec,52℃30sec,72℃5min,循環(huán)30次,末次72℃延伸10min;(2)連接和轉化:將(1)所得片段使用諾唯贊公司的無縫重組試劑盒按說明書進行首尾連接,然后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,用LB+Amp100平板進行篩選;(3)轉化子鑒定:LB+Amp100平板生長菌落接種LB+Amp100液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),用CTAB法提取質粒,對質粒提取物進行酶切鑒定和測序。
1.3 Donor DNA合成
分別以表1中菌株WC、DH5α和WC基因組DNA為模板,使用表2所示三對引物對P3/P4、P5/P6、P7/P8進行三個片段的擴增:含元件H1和UPRE的PCR1片段;含元件LacZ ORF的PCR3片段;含元件TadhI和H2的PCR2片段。分別以PCR1和PCR3為模板,使用引物對P3、P6進行第一輪重疊交叉延伸PCR反應,產(chǎn)物命名為PCR13,預期長度3 439bp;以PCR13和PCR2為模板,使用引物對P3、P8進行第二輪重疊交叉延伸PCR反應,產(chǎn)物命名為PCR123,預期長度3 721bp。PCR反應條件為:95℃5min,94℃30sec,(52~56)℃30sec,72℃(1~5)min,循環(huán)30次,末次72℃延伸10min。
1.4釀酒酵母感受態(tài)細胞的制備及轉化
按文獻中的方法制備感受態(tài)細胞并進行轉化、篩選和鑒定,具體如下:(1)YCplac33-Cas9轉化:表1質粒YCplac33-Cas9轉化菌株W303-1A和An-a感受態(tài)細胞,利用CM'G-URA平板進行篩選,得到W303-1A(YCplac33-Cas9)和An-a(YCplac33-Cas9);(2)指示菌株構建:制備菌株W303-1A(YCplac33-Cas9)和An-a(YCplac33-Cas9)感受態(tài)細胞,將質粒pRS42H-gLEU2和donor DNA片段共轉化,利用(CM'G-URA+HyB)平板篩選,生長菌落復制到(CM'G-URA+HyB)平板復篩,進一步點接到平板YPD+Tm+X-Gal進行顯色,呈現(xiàn)藍色者接種液體培養(yǎng)、提取染色體DNA,然后進行菌落PCR鑒定及PCR產(chǎn)物測序。PCR鑒定引物對為P9、P10。測序為預期序列者進一步進行5'-FOA平板反選,以篩選得到質粒YCplac33-Cas9丟失的陽性轉化子菌株。
質粒BG的轉化方法同YCplac33-Cas9轉化。
1.5生長評價
挑取固體培養(yǎng)基平板上新鮮生長的菌落,接入裝有5ml YPD培養(yǎng)液的試管中,30℃、220r/min培養(yǎng)過夜,轉接進行二次液體培養(yǎng),所得菌液為種子液;接種到裝有50ml YPD培養(yǎng)液的250ml搖瓶中,控制起始OD600=~0.2,30℃、220r/min培養(yǎng),定期取樣測定OD600值,繪制生長曲線。
當碳源為纖維二糖時,試管種子液培養(yǎng)改為CMG-URA培養(yǎng)基,而搖瓶培養(yǎng)基改為YPC,定期取樣測定OD600值和β-葡萄糖苷酶及β-半乳糖苷酶酶活,其余類上。
1.6對酸醇的UPR信號響應評價
將菌株W303-1A(leu 2∷UPRE-lacZ)和An-a(leu 2∷UPRE-lacZ)經(jīng)過兩次YPD液體培養(yǎng)基活化,接種于裝有105ml YPD培養(yǎng)基的500ml搖瓶中,控制初始OD600≥0.2,30℃、220r/min條件下培養(yǎng),當OD600=2時停止培養(yǎng),分別分裝到5個100ml搖瓶中,每瓶菌液20ml,添加不同物質;考慮到乙醇容易揮發(fā),添加乙醇后的搖瓶,統(tǒng)一用美國Parafilm封口膜封上數(shù)層,于30℃、150r/min條件下限氧培養(yǎng);定期取樣測定OD600和β-半乳糖苷酶即Lac Z的比酶活值。
1.7β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶酶活測定
β-半乳糖苷酶酶活測定:“技術和方案7酵母β-半乳糖苷酶的測定”方法進行細胞裂解和粗提物制備、酶活測定;粗提物的蛋白質含量測定使用北京天根公司Bradford蛋白質定量試劑盒,操作按試劑盒說明書操作指南進行。酶活單位U定義為:在測定條件下,1min內水解產(chǎn)生1nmol ONP所需的酶量;粗酶液比酶活定義為:U/mg蛋白質(nmol ONP/min/mg蛋白質)。
β-葡萄糖苷酶酶活測定:參見文獻。
需要說明的是:上述1.5到1.7的測定均至少設兩次重復,結果里使用典型的、有代表性的數(shù)據(jù)。
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