1.2.1.2rdrA敲除菌株構(gòu)建
分別使用rdrA-SY-F/R、rdrA-XY-F/R引物擴(kuò)增F44基因組rdrA基因上下游各1000bp左右同源臂,以pCS1966質(zhì)粒為載體,使用BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)連接至載體上。用同源重組雙交換原理敲除靶標(biāo)基因，通過含有5-氟乳清酸的合成培養(yǎng)基篩選得到rdrA缺失型菌株，使用rdrA-NB-F/R、rdrA-XJ-F/R引物進(jìn)行菌落PCR并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。設(shè)計(jì)引物如表2所示。
表2rdrA敲除菌株構(gòu)建引物序列
1.2.2表型檢測
1.2.2.1生長曲線和pH曲線
F44、DeltardrA和FrdrA菌株連續(xù)活化3代后,按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于100mL液體種子培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng),每2h混勻菌液并取樣,測定600nm波長處的吸光度OD_{600~{}nm}和pH值,繪制生長曲線和pH曲線。
1.2.2.2Nisin耐受
稱取1000IU/mg的NisinZ標(biāo)準(zhǔn)品溶于化開的固體種子培養(yǎng)基,制備得到含10000IU/mL的Nisin固體種子培養(yǎng)基。將活化3代后的F44和DeltardrA菌株培養(yǎng)8h,調(diào)整OD_{600~{}nm}至一致,等濃度梯度稀釋后將10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋菌液各吸取10μL依次在平板上點(diǎn)樣，30℃下培養(yǎng)2~3d，觀察菌落生長情況。
1.2.2.3酸耐受
檢測F44、DeltardrA和FrdrA菌株在pH3.0環(huán)境下應(yīng)激1h后的存活率?；罨?代后的3種菌株培養(yǎng)至7h時(shí)分別取5mL,以8000r/min離心5min,棄凈上清液，加入5mLpH3.0的種子培養(yǎng)基吹吸混勻繼續(xù)培養(yǎng)1h。將酸應(yīng)激前后的菌液分別等濃度梯度稀釋至合適濃度，在固體種子培養(yǎng)基上涂布計(jì)數(shù)。以酸應(yīng)激后活菌數(shù)與酸應(yīng)激前的活菌數(shù)之比記作菌株存活率，反映菌株酸耐受能力。
1.2.2.4Nisin效價(jià)
用改良LB培養(yǎng)基充分活化藤黃微球菌，稀釋至合適濃度后加入化開的固體效價(jià)培養(yǎng)基，待凝固后打孔作為效價(jià)檢測培養(yǎng)基。稱取1000IU/mg的NisinZ標(biāo)準(zhǔn)品分別配制50、100、200、400IU/mL的Nisin標(biāo)準(zhǔn)液加入效價(jià)檢測培養(yǎng)基孔內(nèi)，以抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，以10為底的標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將活化3代后的F44和DeltardrA菌株按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)至6、8、10、12h時(shí)各取500μL菌液加入500μL0.02mol/LHCl溶液，混勻后金屬浴100℃煮沸5min,12000r/min離心3min,取上清加入培養(yǎng)基孔內(nèi)，測量抑菌圈直徑，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Nisin效價(jià)。
1.2.3轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序
將活化3代的F44和DeltardrA菌株培養(yǎng)5h至對(duì)數(shù)中期,4℃下以8000r/min離心3min,收集菌體制備轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序樣品。提取細(xì)菌總RNA,隨機(jī)打斷后經(jīng)兩次合成獲得cDNA第2鏈，經(jīng)修復(fù)、連接、擴(kuò)增、純化后獲得文庫。文庫質(zhì)控合格后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，對(duì)原始數(shù)據(jù)過濾后，用每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數(shù)目(Fragmentsperkilobasespermillionfragments,FPKM)表示基因原始表達(dá)量。采用DEseq軟件對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，以log2foldchange表示試驗(yàn)組與對(duì)照組基因表達(dá)量差異倍數(shù)，以P<0.05且log2foldchange(DeltardrA/F44)
1為篩選條件，獲得顯著差異表達(dá)基因并進(jìn)行后續(xù)分析。
1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證
對(duì)培養(yǎng)至與轉(zhuǎn)錄組學(xué)送測樣品相同條件的F44和DeltardrA菌株用細(xì)菌總RNA提取試劑盒DP430提取總RNA。使用2xSYBRGreenqPCRMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。然后在LightCycler480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR試驗(yàn),以16SrRNA基因作內(nèi)參,進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),用2-DeltaDeltaCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。設(shè)計(jì)引物如表3所示。
表3實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列
1.2.5數(shù)據(jù)處理
使用Excel2021匯總分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);使用OriginPro2021繪制圖表。使用t檢驗(yàn)計(jì)算差異顯著性,其中P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。
2結(jié)果與分析
2.1突變菌株構(gòu)建
利用電轉(zhuǎn)化方法將測序無誤的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌,使用pLEB124-YZ-F/R引物進(jìn)行菌落PCR并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，成功得到F44-rdrA過表達(dá)菌株,記作FrdrA。陽性結(jié)果條帶為977bp,對(duì)應(yīng)圖1A中泳道1~泳道8。
利用同源重組方法構(gòu)建乳酸乳球菌F44-rdrA敲除菌株，經(jīng)過單交換和雙交換兩輪篩選后，使用rdrA-NB-F/rdrA-NB-R、rdrA-XJ-F/rdrA-XJ-R引物進(jìn)行菌落PCR并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，成功得到F44-rdrA敲除菌株，記作DeltardrA，陽性結(jié)果對(duì)應(yīng)圖1B中的泳道5、泳道6、泳道7、泳道24，其中圖1B為rdrA-NB-F/rdrA-NB-R引物PCR結(jié)果，陽性結(jié)果為無條帶;圖1C為rdrA-XJ-F/rdrA-XJ-R引物PCR結(jié)果，陽性結(jié)果條帶為403bp。
2.2表型結(jié)果分析
通過測定生長曲線和pH曲線發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)44、DeltardrA和FrdrA菌株生長情況無顯著區(qū)別，菌株生長遲緩期、對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期的時(shí)間、菌體量和菌液pH值基本保持一致(圖2A、圖2B)。
對(duì)F44和DeltardrA進(jìn)行Nisin耐受性試驗(yàn),結(jié)果如圖2C所示,DeltardrA菌株的最大有效稀釋量為1:10^6,F44對(duì)照菌株的最大有效稀釋量僅為1:10^4，敲除rdrA基因使F44菌株Nisin耐受能力增強(qiáng)。
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