1.3方法
1.3.1噬菌體分離純化
采集污水樣品，以PM B2為宿主菌進(jìn)行噬菌體分離。將污水樣品以8 000×g離心10 min，使用0.22μm濾器進(jìn)行過濾。取對數(shù)生長期的PM B2菌懸液2 mL加入3 mL的LB液體培養(yǎng)基中，與過濾后的污水均勻混合。37℃恒溫振蕩培養(yǎng)6～8 h，將培養(yǎng)物在12 000×g離心5 min，用0.22μm濾器過濾，得到噬菌體增殖液。各取100μL噬菌體增殖液和PM B2菌懸液混勻后加入至融化的LB半固體培養(yǎng)基，混勻后覆蓋在LB固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個透亮噬菌斑使用雙層平板法連續(xù)純化4～5次，以獲得純化的噬菌體。取純化噬菌體液加入到對數(shù)生長期宿主菌中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)4～6 h，收集培養(yǎng)液經(jīng)離心、過濾后得到噬菌體增殖液置于4℃保存。
1.3.2噬菌體透射電鏡觀察
采用磷鎢酸負(fù)染法進(jìn)行觀察。取10μL（1010 PFU/mL）的噬菌體原液滴加在銅網(wǎng)上，靜置5 min，然后用2%磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，濾紙吸去多余染色液，自然晾干。將制備好的樣品置于透射電鏡下觀察。
1.3.3噬菌體生物學(xué)特性測定
1.3.3.1噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MO?）測定
將100μL噬菌體懸液添加到900μL PM B2（約107 CFU/mL）中，以獲得不同MO?（噬菌體數(shù)量/被感染細(xì)菌數(shù)量＝100、10、1、0.1、0.01、0.001）的混合溶液。混合溶液在搖床培養(yǎng)箱中以180 r/min的振蕩速度37℃培養(yǎng)4 h，采用雙層平板法測定其效價。
1.3.3.2噬菌體一步生長曲線
將噬菌體液與宿主菌按照噬菌體MO?＝0.1混合均勻，在37℃條件下孵育15 min后，8 000×g離心10 min，棄上清液，再用LB液體培養(yǎng)基洗滌3次，以去除未吸附的噬菌體。隨后加入30 mL預(yù)熱LB液體培養(yǎng)基，37℃、160 r/min振蕩孵育120 min，每10 min吸取100μL樣品測定噬菌體效價。
1.3.3.3噬菌體pH值穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性測定
為測定噬菌體不同pH值條件下的穩(wěn)定性，將100μL噬菌體懸液添加到900μL不同pH值（2～12）的SM緩沖溶液中，37℃條件下孵育1 h后，使用雙層平板法測定其效價，每組重復(fù)3次。
為測定噬菌體在不同溫度條件下的穩(wěn)定性，取1 mL噬菌體液分裝于1.5 mL離心管中，分別置于4、25、37、40、50、60℃和70℃中孵育1 h后，使用雙層平板法測定其效價，每組重復(fù)3次。
1.3.3.4不同MO?噬菌體對細(xì)菌的裂解能力測定
將噬菌體（約為108 PFU/mL）和PM B2（約為107 CFU/mL）按照MO?＝0.001、0.01、0.1、1和10各取100μL于96孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同時設(shè)置對照組為僅加入細(xì)菌菌液和只含有LB培養(yǎng)基的空白組，每隔30 min檢測OD600 nm值，共檢測12 h。
1.3.3.5噬菌體宿主譜測定
為檢測噬菌體宿主范圍，采用點(diǎn)斑實驗法對所有菌株（標(biāo)準(zhǔn)株為大腸桿菌ATCC 35150、沙門氏菌ATCC 14028、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和金黃色葡萄球菌ATCC 25923）進(jìn)行檢測。取100μL細(xì)菌菌液加入到LB半固體中，混勻后均勻鋪在LB固體平板上，冷卻后取10μL噬菌體液滴加在雙層平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察平板上是否出現(xiàn)噬菌斑。
1.3.4噬菌體基因組提取及全基因組分析
按照病毒基因組提取試劑盒操作說明提取噬菌體基因組，將滿足測序要求的噬菌體基因組提交至生物公司進(jìn)行測序。使用?llumina NovaSeq平臺進(jìn)行測序，測序數(shù)據(jù)通過A5-MiSeq和SPAdes對噬菌體基因組進(jìn)行拼接。使用NCBI對噬菌體進(jìn)行核苷酸序列比對，使用RAST在線網(wǎng)站（http://rast.nmpdr.org/）注釋基因組，注釋后在NCBI的BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具中進(jìn)行校驗。通過CARD數(shù)據(jù)庫（https://card.mcmaster.ca/home）和毒性因子數(shù)據(jù)庫（http://www.mgc.ac.cn/VFs/）檢測噬菌體基因組中是否存在抗生素抗性基因和毒力基因。通過NCBI數(shù)據(jù)庫分析比較與噬菌體PL1末端酶大亞基的相關(guān)基因序列，并使用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。噬菌體全基因組已提交至GenBank，基因登錄號為PP502408。
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