禽呼腸病毒(Avian reovirus，ARV)是呼腸病毒科、正呼腸病毒屬的成員，為雙鏈RNA病毒，無(wú)囊膜，含10個(gè)節(jié)段，雙衣殼結(jié)構(gòu)，可感染雞、火雞、鵝、鴨及一些鳥(niǎo)類(lèi)，臨床主要癥狀包括病毒性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、腸道病、矮小綜合征、吸收不良綜合征及免疫抑制等，是家禽養(yǎng)殖業(yè)中一類(lèi)重要的傳染病，嚴(yán)重危害著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
ARV于1954年由Fahey和Crawley從病雞中分離得到；Olson等于1957年報(bào)道雞群中有滑膜炎并分離出病原，1972年被確定為禽呼腸病毒。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，我國(guó)各省份及地區(qū)陸續(xù)報(bào)道了ARV感染的疫情，對(duì)ARV的研究也日漸深入，Vanderheide等用ARV S1133株生產(chǎn)出了第一代的商品化活疫苗應(yīng)用于生產(chǎn)；2012年起，我國(guó)ARV感染疫情逐漸擴(kuò)大，主要癥狀也呈現(xiàn)復(fù)雜化、多樣化。目前，養(yǎng)殖場(chǎng)普遍存在ARV感染，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。研究表明，ARV的細(xì)胞親嗜性較廣，能在綠猴腎細(xì)胞(Vero)、犬腎細(xì)胞(MDCK)、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、乳地鼠細(xì)胞(BHK-21/13)等多種細(xì)胞系中增殖，且產(chǎn)生穩(wěn)定典型細(xì)胞病變。丁明洋等用鴨呼腸病毒TH11感染BHK-21細(xì)胞后可有效增殖，出現(xiàn)了穩(wěn)定病變；黃莉等用ARV強(qiáng)、弱毒株分別接種Vero細(xì)胞，并分析了接毒后細(xì)胞蛋白表達(dá)的差異；余愛(ài)花等研究了3株鴨源ARV對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞的致病性，分析了接毒后細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平的差異性。
有關(guān)ARV的研究已經(jīng)較為深入，但研究ARV在DF1細(xì)胞上的增殖特性還未見(jiàn)報(bào)道，本文就此展開(kāi)研究。通過(guò)將ARV S1133毒株接種DF1細(xì)胞，研究其增殖特性，旨在為下一步ARV致病機(jī)理的研究和細(xì)胞滅活苗的研制奠定技術(shù)和理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、2.5 g/L胰酶,Gibco公司產(chǎn)品；PBS，Solarbio公司產(chǎn)品；禽呼腸S1133標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；DF1細(xì)胞，由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。
1.2方法
1.2.1引物設(shè)計(jì)及合成
參考NCBI上的ARV S1133株S2基因的核苷酸序列(登錄號(hào)：KF741763.1)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由華大基因公司合成，引物序列見(jiàn)表1。
1.2.2 ARV S1133接種
DF1細(xì)胞將ARV S1133接種至生長(zhǎng)良好的DF1細(xì)胞上，37℃孵育2h，更換維持液(含20 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基)，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2中37℃培養(yǎng)，觀察CPE。培養(yǎng)3 d后收細(xì)胞培養(yǎng)物，置-80℃凍存?zhèn)溆?。取上述病毒液再接種細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，重復(fù)接毒3次。置-80℃凍存?zhèn)溆?，測(cè)定第3代細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒滴度。
表1 ARV S2基因的核苷酸序列
1.2.3 RT-PCR檢測(cè)
收獲接毒后培養(yǎng)48 h的第3代細(xì)胞培養(yǎng)物，提取病毒RNA，用ARV通用引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將其作為模板用表1中的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 248 bp。PCR程序?yàn)?4℃5 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃70 s，循環(huán)數(shù)為35；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.2.4一步生長(zhǎng)曲線的繪制
將上述收獲的第3代病毒液接種DF1細(xì)胞，分別收取接毒后12、24、36、48、72、96、120 h的病毒液，置-80℃凍存?zhèn)溆谩F1細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞板上，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察CPE及記錄CPE孔數(shù)(重復(fù)此過(guò)程3次)。按Reed-Meunch法計(jì)算7個(gè)時(shí)間段的半數(shù)組織感染量(TCID50)(取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值)，繪制ARV在DF1細(xì)胞上的一步生長(zhǎng)曲線。
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