2.3生長曲線分析
對數(shù)生長早期（培養(yǎng)4h）和對數(shù)生長晚期（12h）檢測并比較不同菌株培養(yǎng)液的A600值，結(jié)果顯示，高滲應(yīng)激環(huán)境下t4606缺陷株（Δt4606）的生存能力明顯弱于野生株（4h：t＝22.725，P＜0.05；12h：t＝5.008，P＜0.05），回補t4606基因至t4606缺陷株后，細菌生存能力恢復(fù)至野生株水平（4h：t＝3.559，P＞0.05；12h：t＝0.404，P＞0.05），說明t4606基因在細菌適應(yīng)高滲應(yīng)激環(huán)境時發(fā)揮了重要作用。生長曲線如圖3所示。
圖3不同菌株在高滲應(yīng)激環(huán)境下的生存曲線
3討論
傷寒沙門菌作為食源性致病菌，常通過污染食物而經(jīng)消化道入人體內(nèi)，進而造成全身性感染，嚴重時可危及感染患者的生命。全球每年約有2 100萬人感染傷寒沙門菌，其中死亡人數(shù)超過21萬，即使在發(fā)達國家，傷寒沙門菌的暴發(fā)流行也時有發(fā)生。傷寒沙門菌在致病過程中，必須克服人體腸道內(nèi)的高滲應(yīng)激環(huán)境才能最終致病。在應(yīng)激環(huán)境下，細菌需要及時有效地調(diào)節(jié)某些基因的表達和蛋白的活性，從而適應(yīng)新的環(huán)境。盡管傷寒沙門菌已成為重要的原核生物研究模式菌，其全基因組結(jié)構(gòu)也已闡明，然而仍然有近三分之一基因的功能尚不明確，而這些基因在細菌生存過程中可能具有極為重要的生物學作用。隨著一些未知基因功能的逐步明確，對傷寒沙門菌致病機制的認識也將進一步深入。然而，如何選擇在傷寒沙門菌適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境時發(fā)揮重要作用的未知功能基因，是后續(xù)研究工作中的難點。
筆者前期利用傷寒沙門菌全基因組芯片，研究了高滲應(yīng)激環(huán)境下的兩個重要調(diào)節(jié)因子（RpoE和RpoS）的雙重調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在傷寒沙門菌處于高滲應(yīng)激環(huán)境時，t4606基因的表達同時受到RpoE和RpoS的雙重調(diào)控，說明t4606基因在傷寒沙門菌適應(yīng)高滲應(yīng)激環(huán)境方面具有重要的意義。進一步利用生物信息學軟件對t4606基因序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，t4606基因具有70%的Patatin樣磷脂酶基序，可能編碼一種Patatin樣磷脂酶。Patatin樣磷脂酶和細菌的侵襲性和毒力密切相關(guān)。Banerji和Flieger的研究表明，具有致病性的細菌內(nèi)，含有Patatin樣編碼區(qū)域的蛋白比非致病性細菌更為常見。也有研究表明，銅綠假單胞菌肺炎患者體內(nèi)出現(xiàn)急性肺損傷，有可能是由銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的ExoU毒素進入真核細胞的細胞質(zhì)所致。ExoU毒素由exoU基因編碼，而exoU基因類似于傷寒沙門菌t4606基因，其所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列中具有Patatin樣磷脂酶片段，且該片段與哺乳動物體內(nèi)的非鈣離子依賴性磷脂酶A2具有同源性，并且ExoU毒素的溶血磷酸酶A活性和細胞毒作用與該片段有關(guān)。傷寒沙門菌中是否存在Patatin樣磷脂酶尚無文獻報道，值得進一步深入研究。
本研究采用分子生物學技術(shù)，結(jié)合t4606基因的特性，通過優(yōu)化相關(guān)實驗條件，成功制備了傷寒沙門菌t4606基因缺陷株及其回補株，并觀察了不同菌株在模擬人體腸道高滲應(yīng)激環(huán)境下的生存能力。通常情況下，腸道致病菌在進入人體腸道后，必須適應(yīng)環(huán)境滲透壓的巨大改變，即從食物中的低滲環(huán)境到腸道內(nèi)的高滲環(huán)境。致病菌只有適應(yīng)了新的滲透壓環(huán)境，才能侵襲腸上皮細胞。因此，了解傷寒沙門菌適應(yīng)人體腸道內(nèi)高滲應(yīng)激環(huán)境的機制，對進一步分析傷寒沙門菌的整體致病機制具有重要的意義。本研究中的生長曲線分析證實，高滲應(yīng)激環(huán)境下，t4606缺陷株的生長能力明顯弱于野生株，但在回補t4606基因至t4606缺陷株后，其生長能力恢復(fù)至野生株水平。由此可見，t4606基因在傷寒沙門菌適應(yīng)高滲應(yīng)激環(huán)境方面發(fā)揮著重要的作用。
本文對高滲應(yīng)激環(huán)境下傷寒沙門菌t4606基因的生物學功能進行了初步研究，為進一步深入了解t4606基因在傷寒沙門菌中發(fā)揮作用的機制奠定了基礎(chǔ)，也說明t4606有可能作為臨床預(yù)防和治療傷寒沙門菌感染的靶向基因，為傷寒沙門菌感染的臨床分子靶向治療提供了新的研究方向。
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