1.2.5 entB基因缺失株分泌腸菌素試驗(yàn)
配制鉻天青S(chromeazurolS，CAS)培養(yǎng)基，用于腸菌素的定性檢測(cè)。將大腸桿菌親本株(WT)和突變株(Mu1、Mu2)分別在LB肉湯中培養(yǎng)至D600nm值為1.0，在CAS瓊脂板上打孔，每孔加入10μL菌液，置37℃培養(yǎng)24h后觀察拍照。
1.2.6生長(zhǎng)曲線測(cè)定
參考呂佩帥等方法測(cè)定菌株生長(zhǎng)曲線，將大腸桿菌WT、Mu1、Mu2菌株分別接種至LB肉湯中培養(yǎng)，8000r/min離心2min收集菌體沉淀，經(jīng)PBS洗滌2次后，調(diào)整菌懸液D600nm值為1.0，將菌懸液按1∶100比例分別接種至已添加LB和T-medium培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線培養(yǎng)板中。每隔1h測(cè)定D600nm值，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行孔，試驗(yàn)重復(fù)3次，取D600nm平均值繪制生長(zhǎng)曲線。
1.2.7促生長(zhǎng)試驗(yàn)
在MH固體培養(yǎng)基中進(jìn)行大腸桿菌腸菌素對(duì)空腸彎曲菌的促生長(zhǎng)試驗(yàn)。將空腸彎曲菌NCTC11168新鮮培養(yǎng)液以1∶250比例添加至50℃的MHA中，加入鐵螯合劑DFO(終濃度為20μmol/L)混合均勻，倒入培養(yǎng)皿中凝固并打孔，將大腸桿菌AN102的WT、Mu1和Mu2菌株在T-medium中培養(yǎng)24h，離心取上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行真空離心濃縮約10倍，在相應(yīng)孔中加入10μL濃縮液，置三氣培養(yǎng)箱(10%CO2，5%O2，85%N2)培養(yǎng)后觀察菌株生長(zhǎng)圈并拍照。利用大腸桿菌培養(yǎng)后的上清液接種空腸彎曲菌，測(cè)定對(duì)空腸彎曲菌的促生長(zhǎng)作用，具體操作如下:利用上述過(guò)濾的大腸桿菌培養(yǎng)上清液(未濃縮)與添加鐵螯合劑DFO(終濃度為20mol/L)的-m新ed鮮iuMmH替肉代湯培培養(yǎng)養(yǎng)上基清按液照作1∶為1對(duì)比照將新鮮培養(yǎng)的空腸彎曲菌NCTC11168菌液經(jīng)T?medium洗滌并重懸后，按1∶50比例接種至混合培養(yǎng)液中，置三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0、12、24和36h取菌液涂板計(jì)數(shù)。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Originpro2017軟件進(jìn)行計(jì)算，利用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P小于0.05表示差異顯著，P小于0.01表示差異極顯著。
2結(jié)果
2.1雞腸道臨床大腸桿菌分離株腸菌素的測(cè)定
對(duì)雞腸道臨床大腸桿菌分離株分泌腸菌素的水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，30株大腸桿菌分離株均可分泌不同水平的腸菌素，培養(yǎng)上清中腸菌素濃度介于11~126μmol/L之間(圖2)。
圖2雞腸道臨床大腸桿菌分離株腸菌素測(cè)定
2.2 entB基因缺失株的鑒定
利用λRed同源重組系統(tǒng)構(gòu)建大腸桿菌entB基因缺失株Mu1和Mu2，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，親本株擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1188bp，Mu1突變株擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1474bp，Mu2突變株擴(kuò)增產(chǎn)物大小為510bp(圖3)，片段大小與預(yù)期相符。
M，DL5000DNA Marker;1，親本株WT;2，突變株Mu1;3，突變株Mu2
圖3大腸桿菌entB基因缺失株P(guān)CR鑒定結(jié)果
2.3 entB基因缺失株分泌腸菌素的檢測(cè)分別利用CAS試驗(yàn)和ic-ELISA方法檢測(cè)大腸桿菌親本株和突變株Mu1、Mu2分泌腸菌素的能力。CAS結(jié)果顯示，大腸桿菌AN102和ATCC25922親本株分泌腸菌素后瓊脂由藍(lán)色變?yōu)辄S色，在接種環(huán)周圍形成較大的黃色暈圈，而突變株Mu1和Mu2接種環(huán)周圍黃色暈圈較小(圖4)。ic-ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，大腸桿菌AN102和ATCC 25922親本株中腸菌素濃度為100~150μmol/L，而突變株Mu1和Mu2中均未檢測(cè)腸菌素(圖5)。
圖4 CAS定性檢測(cè)腸菌素
圖5 ic-ELISA定量檢測(cè)腸菌素
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