1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗菌株和質(zhì)粒大腸桿菌AN102、ATCC25922由畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點實驗室保存;人源空腸彎曲菌參考菌株NCTC11168由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所惠贈;30株雞腸道臨床大腸桿菌菌株分離自2020—2023年北京郊區(qū)多個養(yǎng)雞場泄殖腔拭子樣品;λRed重組系統(tǒng)所用質(zhì)粒pKD3、pKD46、pCP20由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院惠贈。
1.1.2主要試劑及儀器細菌培養(yǎng)基
購自ThermoFisherScientific公司;DpnⅠ限制性內(nèi)切酶購自New EnglandBiolabs公司;分子生物學(xué)試劑盒和PCR試劑均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;腸菌素純品、氨芐青霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖均購自Sigma-Aldrich公司;ELISA用試劑包被液、終止液、顯色液均購自北京索萊寶科技有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自Abcam公司。MicroPulser Electroporator電擊儀(GenePluserXcell)和凝膠成像儀(GelDocTM XR+)均購自Bio-Rad公司;MastercyclernexusPCR儀和臺式離心機(5840R)購自Eppendorf公司;Heracell三氣培養(yǎng)箱、NanoDrop2000核酸測定儀購自ThermoFisherScientific公司;BioScreenerC全自動生長曲線分析儀購自O(shè)yGrowthCurvesAbLtd公司;SynergyH1多功能酶標(biāo)測定儀購自Bio-Tek公司。
1.2方法
1.2.1大腸桿菌腸菌素樣品制備
用LB肉湯分別培養(yǎng)30株雞腸道臨床大腸桿菌分離株，配制T-medium培養(yǎng)液，8000r/min離心2min收集菌體后用T-medium培養(yǎng)液重復(fù)洗滌2次，將菌液D600nm值調(diào)為1.0后按照1∶100比例接種新鮮T-medium培養(yǎng)液，37℃振搖培養(yǎng)24h后收集菌液，經(jīng)5000r/min離心3min后收集培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)測定腸菌素濃度。
1.2.2間接競爭ELISA(ic-ELISA)檢測腸菌素含量
研究報道，利用ic-ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中腸菌素含量。用包被液稀釋包被抗原Ent-BSA(終濃度為1ng/μL)，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，置4℃孵育過夜，經(jīng)洗滌封閉后，加入不同濃度的腸菌素和待測細菌培養(yǎng)上清液樣品50μL，再加入稀釋后的腸菌素單抗(1∶256000稀釋)孵育2h，經(jīng)洗滌后加入100μL稀釋后的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶8000)，37℃孵育1h，洗滌后每孔加入100μLTMB單組份顯色液，避光顯色15min后加入50μL終止液，每個樣品做2個平行孔，試驗重復(fù)3次，利用多功能酶標(biāo)測定儀測D450nm和D630nm值，計算每個樣品的D值(D=D450nm―D630nm)，利用腸菌素純品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算腸菌素含量。
1.2.3引物設(shè)計
參照GenBank中大腸桿菌基因組(登錄號:NC_000913.3)信息，以及pKD3質(zhì)粒序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計菌株鑒定引物EC-F/R和entB基因缺失引物EC-F1/R1，以及λRed重組系統(tǒng)質(zhì)粒驗證引物，引物序列見表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1引物信息
1.2.4 entB基因缺失株的構(gòu)建及鑒定
利用λRed同源重組系統(tǒng)構(gòu)建大腸桿菌entB基因缺失突變株，如圖1所示。以pKD3質(zhì)粒DNA為模板，通過引物EC-F1/R1進行PCR擴增獲得兩端為entB基因的同源臂序列，中間為氯霉素(Cm)抗性基因片段，擴增產(chǎn)物用DpnⅠ進行酶切，以消除PCR產(chǎn)物中質(zhì)粒DNA的污染，切膠回收后獲得打靶替換entB基因的抗性基因DNA，經(jīng)核酸測定儀定量后保存?zhèn)溆谩?
圖1λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建大腸桿菌entB基因缺失突變株示意圖
利用氯化鈣法將pKD46質(zhì)粒DNA導(dǎo)入擬突變的大腸桿菌菌株中，在含100μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上篩選獲得陽性克隆，使用引物pKD46-F/R對陽性克隆進行PCR驗證。在添加Amp的LB肉湯中30℃振搖培養(yǎng)至D600nm值為0.3，加入L-阿拉伯糖(15 mmol/L)誘導(dǎo)，促進λRed重組酶表達，利用10%甘油水洗滌后制備電轉(zhuǎn)用感受態(tài)細胞，加入打靶用抗性基因DNA進行電轉(zhuǎn)化(1.8kV、200Ω、25μF)，在含25μg/mLCm的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，利用鑒定引物EC-F/R對陽性克隆進行PCR鑒定并測序，獲得對Amp敏感而對Cm抗性的陽性菌株ΔentB∷Cm(Mu1)，保種后備用。利用Mu1菌株制備感受態(tài)細胞，將pCP20質(zhì)粒DNA經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入，挑選陽性克隆至含Cm和Amp的LB固體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，使用引物pCP20-F/R對陽性克隆進行PCR驗證，將陽性克隆傳代至無抗LB液體培養(yǎng)基后30℃振搖培養(yǎng)2h，再將溫度調(diào)至37℃培養(yǎng)，涂布于無抗LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，挑取單菌落篩選出對Amp和Cm均敏感的菌株ΔentB(Mu2)，保種后備用。
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