3.3 ML對PEDV感染3D4/21細(xì)胞基因相對表達(dá)量的影響
PEDV主要編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N。本試驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)液中全時添加ML使PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N基因的相對表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05），表明全時添加ML可以抑制病毒的復(fù)制。然而感染后添加ML卻促進(jìn)了病毒的復(fù)制，該結(jié)果說明病毒感染前添加ML可能會影響病毒的吸附和入侵，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制水平。
IL-6是一種細(xì)胞因子，其水平的變化可反映宿主炎癥程度。有研究表明，當(dāng)機(jī)體受到損傷后會產(chǎn)生炎性反應(yīng)，使IL-6水平提高，受到治療后IL-6水平明顯下降，從而抑制炎性反應(yīng)。IL-8是一類可溶性蛋白質(zhì)，其生物功能主要涉及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。當(dāng)受到外界刺激（細(xì)菌、病毒、真菌等生物因素或者氧化應(yīng)激和非生物因子）時，將會激活相關(guān)通路，從而調(diào)控IL-8 mRNA的表達(dá)，參與組織損傷。IFN-β是I型干擾素的一種，其在宿主防御病毒感染和癌癥免疫檢測中都起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，在坦布蘇病毒感染時添加外源性的IFN-β，發(fā)現(xiàn)IFN-β能抑制坦布蘇病毒的增殖。病毒入侵機(jī)體后通過與模式識別樣受體（PRRs）結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)IFN-β的釋放。干擾素可以進(jìn)一步調(diào)控下游信號分子，促使抗病毒基因，如MXI和ISG15的表達(dá)，從而起到抗病毒的效果。MX1蛋白能夠通過GTP酶活性水解病毒核外殼。而ISG15參與了干擾素刺激因子的修飾過程，它有兩個主要功能：一種是泛素樣功能，能夠結(jié)合和調(diào)節(jié)靶蛋白；另一種是自由形式功能，可以在細(xì)胞內(nèi)分泌或作用，主要與細(xì)胞因子的產(chǎn)生和免疫細(xì)胞的激活有關(guān)。IFITM是干擾素的負(fù)調(diào)控因子，研究表明，它通過抑制病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合，從而抑制病毒的入侵，也能通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子IRF3自噬性降解，負(fù)調(diào)控RLRS介導(dǎo)的I型干擾素產(chǎn)生的信號通路，而IFIT則通過抑制病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，從而阻斷病毒繁殖。
本試驗(yàn)中，在PEDV感染3D4/21細(xì)胞24 h時，IL-6、IL-8和IFN-β基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，說明此時病毒感染已經(jīng)引起宿主的先天免疫反應(yīng)，同時，抗病毒蛋白（如MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1和IFITM3）基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，這可能是PEDV頡頏宿主的固有免疫結(jié)果。而在PEDV感染3D4/21細(xì)胞12 h時，相關(guān)的干擾素抗病毒蛋白（MX1、ISG15、IFIT1和IFITM1等）的基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性變化，可能是此時PEDV已經(jīng)建立復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，以利于其在宿主細(xì)胞生存復(fù)制。這一觀點(diǎn)在MLRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞模型上也得到了證實(shí)。這也可能是PEDV在感染3D4/21細(xì)胞12 h達(dá)到最高復(fù)制水平的原因。根據(jù)病毒的生長曲線，可以看出12 h是病毒基因表達(dá)水平最高的時間點(diǎn)，但此時的細(xì)胞形態(tài)并沒有像Wang等試驗(yàn)中的IPEC細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，這可能是因?yàn)?D4/21是巨噬細(xì)胞的一種，其固有免疫反應(yīng)比腸上皮細(xì)胞強(qiáng)，也說明了先天免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的反應(yīng)是宿主抵抗疾病的一個重要因素，隨著感染時間的延長，機(jī)體的天然免疫水平也逐漸增強(qiáng)。PEDV感染24 h使IFN-β基因及抗病毒基因MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1和IFITM3的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，然而ML處理24 h后，這些基因的相對表達(dá)量均顯著下調(diào)，這表明ML加快了3D4/21細(xì)胞免疫狀態(tài)的恢復(fù)，從而使天然免疫基因的相對表達(dá)量恢復(fù)或趨近于control組水平。
MMP13是一種致力于軟骨降解的蛋白酶，其在腫瘤細(xì)胞的惡化、侵襲等生物學(xué)行為方面起著重要作用。本試驗(yàn)中，PEDV感染12 h后使3D4/21細(xì)胞MMP13基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)；添加ML后，3D4/21細(xì)胞MMP13基因的相對表達(dá)量顯著下調(diào)，說明ML可緩解PEDV感染帶來的損害，提高機(jī)體修復(fù)損傷的潛力。KCNJ13是一種鉀離子內(nèi)向整流蛋白，會通過協(xié)助擴(kuò)散的方式運(yùn)輸葡萄糖、氨基酸等離子。
在本試驗(yàn)中，PEDV感染后添加ML處理12 h，3D4/21細(xì)胞KCNJ13基因的相對表達(dá)量顯著下調(diào)，說明ML可以改善腹瀉造成的離子通道損傷，使腸道離子平衡。
ML預(yù)處理細(xì)胞3 h后再進(jìn)行病毒感染，可以顯著降低PEDV基因mRNA水平，說明病毒在3D4/21細(xì)胞中的表達(dá)受到抑制。ML屬于一種中鏈脂肪酸，前期已有大量的關(guān)于ML抗病毒效果的報道，蔣增良研究發(fā)現(xiàn)，0~150 mg/kg的ML可誘導(dǎo)C57/BL6小鼠（4周齡）系統(tǒng)內(nèi)低度炎癥，使得促炎因子TNF?α、IL-6、IL-1β含量顯著升高，抗炎因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）含量顯著降低，進(jìn)一步說明ML具有抗病毒和緩解炎癥反應(yīng)的作用。本試驗(yàn)中，ML對PEDV病毒感染引起的基因相對表達(dá)變化有顯著性的回調(diào)作用，說明本試驗(yàn)條件下，ML發(fā)揮了一定的抗病毒和抗炎的作用，但具體作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。
4結(jié)論
綜上所述，在本試驗(yàn)條件下3D4/21細(xì)胞培養(yǎng)液中ML的適宜添加濃度為10μmol/L；PEDV可以在3D4/21細(xì)胞中復(fù)制增殖，其中在病毒感染細(xì)胞的12 h時病毒基因的相對表達(dá)水平最高；PEDV感染24 h可以促進(jìn)3D4/21細(xì)胞炎性因子和免疫因子的表達(dá)，全時添加ML可在一定程度上抑制病毒增殖，并且有助于機(jī)體免疫狀態(tài)的恢復(fù)。
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細(xì)胞活性、基因表達(dá)的影響（一）
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細(xì)胞活性、基因表達(dá)的影響（二）
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細(xì)胞活性、基因表達(dá)的影響（三）
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細(xì)胞活性、基因表達(dá)的影響（四）
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