番茄（Solanum lycopersicum）是一種在世界范圍內(nèi)廣泛種植的蔬菜作物。番茄病害會(huì)嚴(yán)重影響番茄果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，主要危害番茄植株的葉片、莖和果實(shí)，造成5%～75%的減產(chǎn)，同時(shí)影響果實(shí)的外觀。近年來(lái)，我國(guó)廣西等地有該病害爆發(fā)的報(bào)道，發(fā)病率高達(dá)80%。鑒于其嚴(yán)重的危害性，該病害已被列入我國(guó)的出入境檢疫有害生物名錄。
丁香假單胞菌番茄致病變種Pseudomonas syringae pv.tomato是番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的致病菌，冠菌素（coronatine，COR）是其分泌的一種化合物。黃化癥狀是番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病發(fā)展后期的典型病狀，外源COR處理能夠誘導(dǎo)番茄葉片變黃，表明COR作為致病因子在病害發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。COR的分子式為C18H25NO4，由冠烷酸（CMA）和冠菌酸（CFA）通過(guò)酰胺鍵縮合而得。冠烷酸與乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸酯（ACC）結(jié)構(gòu)類(lèi)似，而冠菌酸與茉莉酸（JA）結(jié)構(gòu)相似。COR與茉莉酸異亮氨酸（JA-Ile），都能與宿主細(xì)胞上的茉莉酸受體蛋白COI1特異結(jié)合。
植物內(nèi)源激素在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，乙烯、茉莉酸和水楊酸是參與植物防御的關(guān)鍵激素。乙烯和茉莉酸在抵抗死體營(yíng)養(yǎng)病原體上發(fā)揮著協(xié)同作用，而水楊酸主要介導(dǎo)植物抵抗半活體營(yíng)養(yǎng)病原菌和活體營(yíng)養(yǎng)病原體的防御反應(yīng)。EIN2是一種跨膜蛋白，其半衰期很短，是乙烯信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)因子。EIN3也是乙烯信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)因子，定位于細(xì)胞核中，是EIN2的下游調(diào)節(jié)蛋白，作為轉(zhuǎn)錄因子激活乙烯響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）催化亞麻酸氧化生成13-氫過(guò)氧化亞麻酸，該反應(yīng)是茉莉酸生物合成的第一步反應(yīng)，因此LOX對(duì)于茉莉酸的生物合成至關(guān)重要，其編碼基因LoxD常被作為茉莉酸通路標(biāo)記基因。MYC2轉(zhuǎn)錄因子是茉莉酸信號(hào)通路的重要蛋白，能夠激活茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑。病程相關(guān)蛋白PR1a由水楊酸誘導(dǎo)產(chǎn)生，被用作水楊酸信號(hào)通路的標(biāo)記蛋白。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，木質(zhì)素、酚類(lèi)、黃酮類(lèi)等多種次級(jí)代謝產(chǎn)物是通過(guò)苯丙烷代謝途徑生成的，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在植物防御中發(fā)揮著重要作用，因此PAL是植物體內(nèi)的重要防御酶。
植物葉片是病原細(xì)菌危害植物的主要組織，細(xì)菌生長(zhǎng)能力測(cè)定可以反映不同菌株在植物組織中的寄生能力，進(jìn)而判斷菌株的毒性。植物在病原菌入侵時(shí)會(huì)激活自身的防御反應(yīng)，胼胝質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞壁增強(qiáng)是一種常見(jiàn)的基礎(chǔ)防御。接種病原細(xì)菌到葉片中數(shù)小時(shí)后，可以在接種葉片的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間觀測(cè)到胼胝質(zhì)沉積。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)COR的研究主要集中在模式植物擬南芥上，而COR在番茄植株上的生理功能及其在細(xì)菌致病過(guò)程中發(fā)揮的作用還不是很清楚。本試驗(yàn)通過(guò)RT-qPCR技術(shù)測(cè)定不同濃度COR處理之后的番茄葉片的防御基因表達(dá)量，揭示了不同濃度下COR的生理功能；通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)和胼胝質(zhì)沉積數(shù)量的測(cè)定，并結(jié)合基因表達(dá)量的分析結(jié)果，證明了丁香假單胞菌分泌的COR能夠促進(jìn)細(xì)菌的毒性，初步探索了COR促進(jìn)病原菌毒性增強(qiáng)的機(jī)理，為番茄細(xì)菌病害防控提供了理論依據(jù)。
1材料和方法
1.1試驗(yàn)材料
①植物：以感病番茄品種“Money maker”為試驗(yàn)材料，種子來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所饋贈(zèng)。
②菌株：野生型致病菌P.syringae pv.tomato DC3000（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Pto）和不能產(chǎn)生COR的突變體cor-，以上菌株均來(lái)源于美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)Dr.Daivd Mackey實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。Pto菌株攜帶利福平抗性，cor-菌株攜帶利福平抗性和卡那霉素抗性。
③試劑：冠菌素（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；Trizol試劑（上海厚凱生物科技有限公司）；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（日本寶生物公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本寶生物公司）；苯胺藍(lán)（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（上海泰坦科技股份有限公司）；乳酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；配置KB培養(yǎng)基試劑：蛋白胨、磷酸氫二鉀、甘油和硫酸鎂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（上海泰坦科技股份有限公司）；氯化鎂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；利福平（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；卡那霉素（上海賢鼎生物科技有限公司）。
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