2結果
2.1細胞裂解上清Westernblot分析結果顯示，SiHa/M、SiHa/R組在4～6 Ku區(qū)域出現目的條帶，而SiHa組無目的條帶(圖1)。
圖1細胞裂解上清的Western blot分析
2.2mBD2對細胞活力的影響第1天SiHa/M、SiHa/R組與SiHa組比較，細胞活力差異無統計學意義(P=0.091)；第2、3天SiHa/M、SiHa/R組細胞活力明顯高于對照組，差異有統計學意義(P=0.018)；第4、5天3組細胞活力差異無統計學意義(P=0.374)(圖2)。
2.3mBD2對細胞凋亡的影響
2.3.1 AnnexinⅤ聯合PI檢測結果結果顯示SiHa/M、SiHa/R及SiHa組AnnexinⅤ+/PI+雙陽性細胞的百分率分別為2.4%、2.3%、2.3%，差異均無統計學意義(P=0.743)；AnnexinⅤ+/PI-細胞分別為0.9%、1.2%、1.5%，差異無統計學意義(圖3)。
圖2穩(wěn)定轉染細胞的細胞活力分析結果
2.3.2 TUNEL檢測結果細胞大小形態(tài)不一，可見凋亡細胞胞核固縮濃染，核質致密，出現核邊緣化，呈半月形；正常細胞胞核相對疏松，無核濃染現象(圖4～6)。SiHa/M、SiHa/R組凋亡細胞發(fā)生率較高，分別為(40.6±4.67)%、(30.2±3.19)%，而SiHa組只有(7.4±1.94)%，SiHa/M、SiHa/R組凋亡細胞發(fā)生率明顯高于SiHa組，差異有統計學意義(P=0.004)；SiHa/M組與SiHa/R組比較，SiHa/M組凋亡發(fā)生率高于SiHa/R組，差異有統計學意義(P=0.003)。
3討論
機體對“非己”的免疫反應需要天然免疫和獲得性免疫系統的協同作用。天然免疫反應不僅提供了抵抗微生物的第一道防線，同時也包含指導獲得性免疫所必需的“危險信號”。防御素是宿主執(zhí)行免疫防御能力的細胞所分泌的、具有殺微生物活性和細胞毒性的小分子多肽，提供直接、即刻的抗微生物效應以保護宿主免受入侵病原微生物損害，是固有免疫中重要的效應分子和調節(jié)分子，廣泛用于抗菌、抗病毒等作用的研究。自首次報道防御素能裂解腫瘤細胞之后，不斷有研究提示防御素與腫瘤免疫有關。研究表明，mBD2可與細胞表面CCR6受體結合，呈劑量依賴性的誘導未成熟樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)CD34+祖細胞源性DCs的移動。進一步的研究顯示，mBD2可與Toll樣受體4(toll like receptor，TLR)結合，誘導骨髓源性DCs成熟。此外，由于腫瘤細胞膜表面特性發(fā)生改變而使得防御素能夠與之結合并產生抗瘤作用也可能是防御素抗腫瘤的機制之一。防御素對腫瘤細胞的殺傷作用遠大于非腫瘤細胞，但這種選擇性殺傷的機制目前尚不清楚。
本研究通過細胞活力測定，顯示SiHa/M、SiHa/R組細胞在貼壁后2～3 d細胞活性明顯低于正常SiHa細胞。隨后，隨著細胞數目增加，培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質消耗增加，細胞代謝產物堆積，細胞活性開始下降，提示mBD2蛋白對細胞活力有一定的抑制作用。這可能與防御素作用于細胞線粒體從而影響腫瘤細胞呼吸、導致細胞代謝紊亂、細胞活力下降有關。SiHa/M、SiHa/R組細胞活力比較，SiHa/M始終低于SiHa/R組，但兩者差異無統計學意義，表明2種蛋白信號肽分子對蛋白活性影響不大。
本研究采用Annexin V聯合PI法和TUNEL 2種方法測定轉染細胞的凋亡情況。2種方法分別檢測凋亡發(fā)生的不同時相，反映誘發(fā)凋亡的不同機制。采用AnnexinⅤ檢測方法觀察細胞凋亡，發(fā)現3組細胞凋亡指數無明顯差別；采用TUNEL染色，結果顯示SiHa/M、SiHa/R組凋亡細胞發(fā)生率較高，與對照組相比差異有統計學意義；SiHa/M組與SiHa/R組比較，SiHa/M組凋亡發(fā)生率高于SiHa/R組。
綜上所述，可以認為mBD2蛋白所誘導的SiHa細胞凋亡主要以腫瘤細胞DNA出現斷裂損傷為主，這與Hariton等研究結果一致。而由于細胞膜損傷導致PS外翻通過AnnexinⅤ檢測方法未能得到驗證，可能是由于早期凋亡所產生的PS外翻過程較為短暫，采用AnnexinⅤ未能捕捉到早期凋亡信號，故檢測陽性率較低。由于SiHa/M與SiHa/R的主要區(qū)別在于兩者所轉染的質粒中插入序列信號肽區(qū)域基因有所不同，是否信號肽及其調控區(qū)序列在成熟肽形成中具有一定的調節(jié)功能，從而對成熟肽功能產生一定影響，還需實驗進一步研究證實。
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