2結(jié)果與討論
2.1植物乳桿菌KLDS1.0386的生長(zhǎng)曲線
植物乳桿菌KLDS1.0386的生長(zhǎng)曲線如圖1所示，該菌生長(zhǎng)情況穩(wěn)定，8 h時(shí)就進(jìn)入了對(duì)數(shù)期，當(dāng)培養(yǎng)到15 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期初期，可用于酶活的測(cè)定。
2.2單因素實(shí)驗(yàn)
2.2.1最佳碳源的篩選在微生物的生長(zhǎng)代謝過程中，碳源是必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，選用最佳碳源，可以讓微生物的生長(zhǎng)達(dá)到最佳狀態(tài)。如圖2所示，幾種碳源對(duì)植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的影響不同，其中葡萄糖對(duì)膽鹽水解酶比酶活影響最大，可達(dá)0.96 U/mg，可溶性淀粉的影響最小，比酶活為0.28 U/mg，因此最佳碳源確定為葡萄糖。
圖1植物乳桿菌KLDS1.0386的生長(zhǎng)曲線
圖2不同碳源對(duì)膽鹽水解酶比酶活的影響
2.2.2最佳氮源的篩選以葡萄糖為碳源，分別添加25 g/L的蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、硫酸銨、酵母粉作為氮源，研究不同氮源對(duì)膽鹽水解酶活性的影響。結(jié)果如圖3所示，氮源不同，膽鹽水解酶的產(chǎn)量也不同，其中蛋白胨和酵母粉對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量有很大的促進(jìn)作用，比酶活分別為0.9 U/mg、0.85 U/mg，因此被選出進(jìn)行復(fù)合氮源優(yōu)化。
圖3不同氮源對(duì)膽鹽水解酶比酶活的影響
2.2.3最佳組合氮源的篩選從四種組合中篩選出最佳的氮源組合，由圖4可知，2號(hào)和4號(hào)對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量影響較大，其中4號(hào)的膽鹽水解酶比酶活達(dá)到1.49 U/mL，酵母粉能夠?yàn)榫纳L(zhǎng)提供生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但由于高含量的酵母粉可能會(huì)抑制該菌的生長(zhǎng)，少量即能達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。
圖4不同氮源組合對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量的影響
2.3Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的回歸分析如表4所示，當(dāng)Prob＞F值小于0.05時(shí)，說明該因素對(duì)膽鹽水解酶的產(chǎn)量有顯著影響，而且F值越大，該因素對(duì)膽鹽水解酶的比酶活影響越大。對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量影響顯著的依次是：A、B、E，且可信度在95%置信區(qū)間內(nèi)，回歸方程為：Y=1.78+0.15A+0.058B+0.042C+8.333E-003D-0.052E-0.032F+0.025G-0.018H，R2=0.9933，說明方程擬合很好，而其他因素對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量影響很小。因此選擇A、B、E 3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，篩選出顯著性因素的產(chǎn)BSH最佳濃度梯度。
表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的回歸分析表
2.4最陡爬坡實(shí)驗(yàn)
最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以葡萄糖、蛋白胨和乙酸鈉作為影響因素，步長(zhǎng)為1 g/L，結(jié)果如表5所示，當(dāng)葡萄糖為18 g/L、蛋白胨為15 g/L、乙酸鈉為3 g/L時(shí)，植物乳桿菌KLDS1.0386所產(chǎn)膽鹽水解酶含量最高，因此，該組合被定為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面分析。
表5最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.5Box-Behnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果
根據(jù)2.4最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，各因素編碼及結(jié)果如表6所示。以膽鹽水解酶比酶活為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行3因素，15次的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，并利用Design-Expet軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)式方程：Y=3.24+0.13A+0.015B+0.05E+0.01AB-0.04BE-0.34A2-0.2B2-0.2E2，決定系數(shù)R2=0.9648。由表7可知，模型p=0.0040＜0.05，說明方程擬合度較好；p失擬項(xiàng)為0.5659＞0.05，說明失擬不顯著；校正性決定系數(shù)R2Adj=0.9015，表明該模型可信度較高，可用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算。
2.6模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
根據(jù)以上模型預(yù)測(cè)，當(dāng)顯著性因素葡萄糖為18.20 g/L、蛋白胨為15.03 g/L、乙酸鈉為3.13 g/L時(shí)，模型預(yù)測(cè)值為3.256 U/mg，在上述條件下進(jìn)行三次模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的膽鹽水解酶比酶活為（3.37±0.21）U/mg，與誤差在允許范圍內(nèi)，因此該模型具有一定的實(shí)踐價(jià)值，可以很好地預(yù)測(cè)該菌產(chǎn)膽鹽水解酶實(shí)際發(fā)酵情況。
表6響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果
3結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)首先通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出適合植物乳桿菌產(chǎn)膽鹽水解酶的最佳碳源和組合氮源，然后采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)法對(duì)初始培養(yǎng)基的主要成分進(jìn)行了篩選，最終選出葡萄糖、蛋白胨和乙酸鈉為影響植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的顯著因素。利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定了顯著因素的最佳濃度值，并以此為中心點(diǎn)進(jìn)行了Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，
表7模型方差分析表
最終確定了植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的最佳培養(yǎng)基成分為：葡萄糖18.2 g/L、蛋白胨15.03 g/L、酵母粉9.97 g/L、乙酸鈉3.13 g/L、檸檬酸氫二銨2.00 g/L、磷酸氫二鉀2.00 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L。優(yōu)化前植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的量為1.04 U/mg，經(jīng)過培養(yǎng)基的優(yōu)化后，膽鹽水解酶的比酶活為3.37 U/mg，比優(yōu)化前提高了3.24倍。
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