摘要:為篩選最適于牛支原體(Mycoplasmabovis)生長的培養(yǎng)基，利用活菌計數(shù)方法測定了牛支原體OF2株在改良Thiaucourts培養(yǎng)基、牛心湯培養(yǎng)基和改良KM2培養(yǎng)基中的生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛支原體在改良Thiaucourts培養(yǎng)基中生長30h即可達到平臺期，平均最高生長滴度7.0×109ccu/mL;在牛心湯培養(yǎng)基中生長40h即可達到平臺期，平均最高生長滴度4.0×109ccu/mL;在改良KM2培養(yǎng)基中生長50h達到平臺期，其平均最高生長滴度為7.0×108ccu/mL。結(jié)果表明，牛支原體在改良Thiaucourts培養(yǎng)基中生長快、滴度高，為下一步牛支原體滅活疫苗的研究提供了參考依據(jù)。
牛支原體(Mycoplasmabovis)是引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎等病的病原體之一。該病原體于1961年首次在美國患有乳房炎的病牛中分離出來，目前在歐洲和北美洲流行并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。2008年，我國部分地區(qū)新從外地引進肉牛暴發(fā)了由M.bovis引起的以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎疫情，發(fā)病率為50%~100%，迄今該病原體已在貴州、寧夏、內(nèi)蒙古、廣西、重慶等省、市、自治區(qū)被發(fā)現(xiàn)。疫苗是有效防制動物傳染病的重要手段之一，但目前我國尚無有關(guān)牛支原體疫苗研究的報道。篩選生長快、滴度高的培養(yǎng)基是滅活疫苗生產(chǎn)工藝研究中的一個重要環(huán)節(jié)。本試驗通過測定牛支原體國內(nèi)分離株OF2在不同基礎(chǔ)液配方的支原體培養(yǎng)基中的生長曲線，以期篩選出合適的牛支原體制苗用培養(yǎng)基，為下一步牛支原體滅活疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
1、材料和方法
1.1菌株及培養(yǎng)基
牛支原體OF2株，2010年分離自寧夏某地患肺炎犢牛肺組織，參照文獻的方法對其進行特異性PCR和16SRNA基因測序分析鑒定為牛支原體，本實驗室凍干保存。
改良Thiaucourts培養(yǎng)基，配方為:PPLO肉湯(21g/L)、滅活馬血清(200mL/L)、25%酵母浸出液(100mL/L)、10%醋酸鉈(1mL/L)、青霉素(0.1g/L)、葡萄糖(1g/L)、丙酮酸鈉(2g/L)、0.4%酚紅(4.5mL/L)。
牛心湯培養(yǎng)基，配方為:1%水解乳蛋白Hank's液(562.5mL)、牛心湯(337.5mL)、馬血清(100mL)、25%酵母浸出液(20mL)、10%醋酸鉈(10mL)、0.4%酚紅(1.8mL)、青霉素(20萬U)。
改良KM2培養(yǎng)基，配方為:MEM(5g)、葡萄糖(0.4g)、丙酮酸鈉(0.2g)、水解乳蛋白(5.1g)、滅活馬血清(200mL)、25%酵母浸出液(20mL)、10%醋酸鉈(1mL)、0.4%酚紅(1mL)、青霉素(20萬U)。
以上所配培養(yǎng)基均用1moL/LNaOH調(diào)pH至7.4~7.8，4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2方法
1.2.1培養(yǎng)基適應(yīng)性試驗取-72℃凍存OF2株菌種3支，分別接種上述3種培養(yǎng)基進行復(fù)蘇、傳代，根據(jù)培養(yǎng)基顏色變化情況記錄支原體生長情況。
1.2.2生長曲線測定
1)菌液培養(yǎng)。將-72℃凍存的OF2菌種移入5mL的改良Thiaucourts、牛心湯和KM2培養(yǎng)基中復(fù)蘇，復(fù)蘇后按體積比1∶20傳代約3~5代，待生長穩(wěn)定后擴大培養(yǎng)到50mL，作為待測菌液，置37℃溫箱中培養(yǎng)，從0h起每隔5h進行活菌計數(shù)。
2)活菌計數(shù)與生長曲線繪制。每隔相應(yīng)的時間從待測菌液取樣，采用活菌梯度稀釋計數(shù)法進行計數(shù)。具體方法是:將改良Thiaucourts、牛心湯和改良KM2培養(yǎng)基各分裝于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔270μL。第1孔加入待測菌液30μL，吹打混勻后，取30μL加入第二孔中，依次重復(fù)以上操作至第10孔，混勻后取30μL棄去。由此待測菌液被稀釋為10-1、10-2、10-3至10-10不同的稀釋度。每種培養(yǎng)基的操作步驟相同，每個時間點分別做3個平行孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于濕盒中37℃恒溫培養(yǎng)，以未接種菌液的培養(yǎng)基為陰性對照，將pH調(diào)至6.8的培養(yǎng)基作為陽性對照。每天觀察接種孔的顏色變化，直至孔顏色不發(fā)生變化為止，最后一個變色孔的稀釋度即為待測菌液的生長滴度，用顏色變化單位(Colorchangeunit，ccu)表示。分別用3份樣品的平均滴度(x，n=3)表示該時間點支原體平均生長滴度。以取樣時間點為橫坐標(biāo)，平均生長滴度的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。
2、結(jié)果
2.1培養(yǎng)基適應(yīng)性試驗結(jié)果
培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，牛支原體OF2株在3種培養(yǎng)基中均可生長。記錄傳代穩(wěn)定后各培養(yǎng)物的顏色變化，結(jié)果見表1。從表1可知OF2株在改良Thiaucourts培養(yǎng)基中生長速度快，12h即可觀察到顏色變化，至30h已完全變黃;在牛心湯、改良KM2培養(yǎng)基中分別需18h、24h肉眼可見生長(顏色變化)。在36h時對培養(yǎng)物進行了計數(shù)，結(jié)果OF2株在改良Thiaucourts培養(yǎng)基、牛心湯培養(yǎng)基中生長滴度均可達到109ccu/mL，而在改良KM2培養(yǎng)基中僅為107ccu/mL。
2.2生長曲線的測定結(jié)果
牛支原體OF2株在改良Thiaucourts培養(yǎng)基、牛心湯培養(yǎng)基和改良KM2培養(yǎng)基中的生長滴度變化見表2，并據(jù)此繪制了生長曲線圖(圖1)。從表2和圖1中可以看出，牛支原體OF2菌株在改良Thiaucourts培養(yǎng)基中平均生長滴度最高可至7.0×109ccu/mL，在30h左右到達平臺期，30~50h之間滴度可維持在109ccu/mL數(shù)量級。牛支原體OF2菌株在牛心湯培養(yǎng)基中最高生長滴度可至4.0×109ccu/mL，在40h左右進入平臺期，40~55h之間滴度可維持在109ccu/mL數(shù)量級。牛支原體OF2菌株在改良KM2培養(yǎng)基中生長相對緩慢，在50h左右進入平臺期，平均生長滴度最高為7.0×108ccu/mL。
3、討論
由于支原體基因組小，自身合成能力較弱，體外培養(yǎng)時所需營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)條件較為嚴(yán)格，因此篩選成本較低且利于牛支原體生長的培養(yǎng)基對牛支原體滅活疫苗的研究具有重要的意義。常見的支原體培養(yǎng)基常在3種不同的基礎(chǔ)液配方上進行改良而來:PPLO，如Eatons、Thiaucourts培養(yǎng)基等;牛心湯，如Hayfilcks、A62培養(yǎng)基和本試驗所用的牛心湯培養(yǎng)基等;富含氨基酸和維生素的人工基礎(chǔ)液，如Freys、改良Freys培養(yǎng)基和改良KM2培養(yǎng)基等。本實驗室此前曾對絲狀支原體山羊亞種、綿羊肺炎支原體等支原體最適培養(yǎng)基進行了篩選，發(fā)現(xiàn)不同的支原體其最適培養(yǎng)基并不一致。因此有必要觀察牛支原體在這3種不同基礎(chǔ)液配方的培養(yǎng)基上的適應(yīng)情況和生長表現(xiàn)。結(jié)果表明，牛支原體在改良Thiaucourts培養(yǎng)基中生長快、滴度高，適合于滅活疫苗生產(chǎn)過程中菌體的培養(yǎng)。當(dāng)然，就所測得的生長曲線而言，本試驗結(jié)果僅是實驗室階段小量培養(yǎng)得到的數(shù)據(jù)，在進行中試規(guī)?；蛏a(chǎn)規(guī)模的牛支原體培養(yǎng)或發(fā)酵罐生產(chǎn)時可作為參考依據(jù)，但擴大規(guī)模后尚需要進一步進行有關(guān)工藝條件的研究。
另外，從培養(yǎng)基材料來源和成本分析，KM2培養(yǎng)基和Thiaucourts培養(yǎng)基中的材料均為商業(yè)化試劑，來源方便且質(zhì)量可控;而牛心湯培養(yǎng)基中的牛心湯目前國內(nèi)尚未見商品，常由實驗室從屠宰場購置后自行制造，除了有生物材料污染的風(fēng)險以外，沒有相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也不符合當(dāng)前農(nóng)業(yè)部發(fā)布的有關(guān)獸用疫苗研制指導(dǎo)原則。因此，從這兩方面看，改良Thiaucourts培養(yǎng)基應(yīng)作為牛支原體滅活疫苗研制的首選培養(yǎng)基。
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