摘要為探索獺兔胃腸道中固有的乳酸菌群，豐富乳酸菌應(yīng)用，選擇中性或偏酸性MRS培養(yǎng)基分離并培養(yǎng)健康獺兔胃腸道中的乳酸菌、16S rDNA測(cè)序?qū)λ@菌株進(jìn)行種屬鑒定、基因組DNA熒光定量PCR檢測(cè)其在40、80日齡的獺兔胃腸道中的相對(duì)含量。結(jié)果從獺兔胃、空腸、盲腸、結(jié)腸、直腸中均分離出1株糞腸球菌；胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸中均分離出1株短乳桿菌；胃、十二指腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸中均分離出1株植物乳桿菌；十二指腸、空腸、盲腸、結(jié)腸中均分離出1株空腸腸球菌。所獲菌株在獺兔胃腸道中普遍分布，并且其相對(duì)水平隨獺兔日齡的增長(zhǎng)而升高，這些菌類有待成為獺兔內(nèi)源乳酸菌飼料添加劑的備用選擇。
獺兔是單胃草食性哺乳動(dòng)物，其消化模式依賴盲腸、結(jié)腸中大量菌群的發(fā)酵作用。在規(guī)?；a(chǎn)中獺兔常因管理不善、致病菌侵染等多種因素誘發(fā)多種腸道疾病，典型癥狀為腸道上皮粘膜受損、免疫屏障被破壞、菌群結(jié)構(gòu)平衡失調(diào)。養(yǎng)殖戶多用廣譜抗生素防治獺兔腹瀉，但抗生素易在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期殘留，破壞腸道菌群的固有平衡并大幅提高病菌的抗藥性，不利于獺兔腸道疾病的長(zhǎng)期防治。
乳酸菌作為腸道益生菌，有利于維持腸黏膜的菌群結(jié)構(gòu)與免疫穩(wěn)態(tài)，抑制大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等致病菌的生長(zhǎng)，提高宿主的免疫力，是理想的抗生素替代物。腹瀉幼兔腸道中的乳酸菌含量減少，及時(shí)補(bǔ)充乳酸菌可改善腹瀉幼兔的腸道環(huán)境、有效治療幼兔腹瀉。外源補(bǔ)充的乳酸菌往往缺乏黏附在家兔腸壁的能力，難以持續(xù)、充分地發(fā)揮益生作用。宿主胃腸道固有的乳酸菌有潛力保持對(duì)宿主的益生功能，故獺兔腸道中附殖的乳酸菌具備重要的利用價(jià)值。為此，本試驗(yàn)采集獺兔腸道內(nèi)容物，對(duì)所含乳酸菌進(jìn)行分離、鑒定，為生產(chǎn)可用性高、效果出色的外源飼料添加劑提供依據(jù)與選擇。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1獺兔胃腸道內(nèi)容物的采集乳酸菌分離及純化所用的樣品
來(lái)自4月齡健康無(wú)病的獺兔12只（公母各半），乳酸菌含量測(cè)定所用的樣品來(lái)自40、80日齡獺兔母兔各5只，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)兔場(chǎng)提供。獺兔于清晨空腹處死后，采集胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸，用生理鹽水沖洗干凈腸道外部表面，用滅菌手術(shù)刀刮取消化道的內(nèi)容物置于1.5 mL無(wú)菌離心管，4℃保存。
1.1.2培養(yǎng)基
中性MRS培養(yǎng)基、酸性MRS培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，按菌株培養(yǎng)所需配置成中性固體CaCO3-MRS培養(yǎng)基（NS）、偏酸性固體CaCO3-MRS培養(yǎng)基（AS）、中性液體MRS培養(yǎng)基（NL）、偏酸性液體MRS培養(yǎng)基（AL）。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1菌株的初篩
無(wú)菌條件下，取1 g腸道內(nèi)容物，加入無(wú)菌水至10 mL，振蕩混勻并經(jīng)紗布過(guò)濾；用無(wú)菌水梯度稀釋至10-6、10-7 g/mL；取200μL稀釋菌液均勻涂布于NS、AS固體培養(yǎng)基，37℃恒溫厭氧倒置培養(yǎng)48 h。判斷菌落的顏色、形態(tài)及溶鈣圈的存在與否，確定進(jìn)一步純化的菌落。
1.2.2菌株的復(fù)篩
無(wú)菌條件下，挑取初篩后的單菌落，采取平板涂布法接種到NL、AL液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)12～16 h；在NS、AS固體平板上劃線分離菌落，并于37℃厭氧倒置培養(yǎng)24～48 h；挑取平板上的單菌落，根據(jù)采樣部位編號(hào)標(biāo)記，并分別接種至NL、AL液體培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)12～16 h，所得單菌落擴(kuò)繁菌液于4℃保存。將200μL擴(kuò)繁菌液接種至固態(tài)平板，挑取平板上的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，最后確定純化的試驗(yàn)菌株。
1.2.3菌株的生理生化鑒定及16S rDNA測(cè)序生理生化鑒定：
按照說(shuō)明書(shū)的操作方法，使用細(xì)菌微量生化鑒定管（海博生物）檢測(cè)菌株的相關(guān)指標(biāo)。
16S rDNA測(cè)序：使用OMEGA細(xì)菌DNA提取試劑盒（Bacterial DNA Kit D3350-01）提取待測(cè)菌株的總DNA，用16S通用引物（27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492 R：3′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-5′）擴(kuò)增V4可變區(qū)，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳、OMEGA膠回收試劑盒［Gel Extraction Kit（100）D2500-01］檢測(cè)并回收擴(kuò)增產(chǎn)物。將純化產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)用MEGA-X軟件以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
1.2.4不同日齡獺兔胃腸道中乳酸菌的相對(duì)含量
根據(jù)測(cè)序所鑒定的乳酸菌種屬，設(shè)計(jì)16S區(qū)域保守序列引物（F：5′-AAGCCTGATGGAGCAAC-3′；R：3′-AATCCGGATAACGCTTG-5′）。提取40、80日齡獺兔胃腸道內(nèi)容物總DNA，以預(yù)變性95℃5 min；變性94℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃30 s，終延伸72℃5 min，34個(gè)循環(huán)的反應(yīng)程序。PCR mix 12.5μL、上下游引物各1μL，總DNA模板2.5μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。
經(jīng)膠回收并純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、構(gòu)建T載體、導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、藍(lán)白斑篩選、陽(yáng)性克隆子測(cè)序鑒定后，將重組質(zhì)粒濃度梯度稀釋至102～109拷貝/μL，作為標(biāo)準(zhǔn)品并計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。擴(kuò)增選擇含SYBRⅡGreen PCR Master mix 10μL、總DNA 2μL、正反向引物各1μL的反應(yīng)體系，以95℃預(yù)變性10 min；變性95℃10 s，退火55℃20 s、延伸72℃20 s，循環(huán)40次的反應(yīng)程序進(jìn)行熒光定量。乳酸菌的拷貝數(shù)通過(guò)Ct值計(jì)算，并以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值表示。
2結(jié)果與分析
2.1乳酸菌的初篩結(jié)果
初篩結(jié)果中，稀釋至10-7 g/mL的菌液涂布后形成的菌落總體稀疏合理，有表面光滑、邊界整齊、生成溶鈣圈的乳白色圓形菌落出現(xiàn)（圖1，左為中性MRS培養(yǎng)基，右為偏酸性MRS培養(yǎng)基）。透明圈是乳酸菌產(chǎn)生的乳酸與MRS平板中的不溶性碳酸鈣反應(yīng)在菌落外周形成的乳酸鈣圈，是形態(tài)鑒定中常用的篩選依據(jù)。腸道乳酸菌普遍適宜pH為5～7，不同菌種乳酸菌的最適pH環(huán)境存在差異。
2.2乳酸菌的復(fù)篩結(jié)果
純化培養(yǎng)后的單菌落革蘭氏染色結(jié)果均呈陽(yáng)性，所檢乳酸菌具球菌、短桿菌、桿狀菌、鏈球菌等不同形態(tài)（圖2）。
2.3乳酸菌的生理生化鑒定及16 S rDNA測(cè)序結(jié)果
由表1可知，各菌株的碳源利用與生理生化情況總體相近。
由表2可知，經(jīng)培養(yǎng)基分離純化后，從獺兔胃腸道7處共檢測(cè)到4種乳酸菌，包括糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和空腸腸球菌（Enterococcus hirae）；各菌種在胃腸道中的檢出結(jié)果見(jiàn)表3，其中植物乳桿菌在7個(gè)部位中的檢出率最高，為85.71%。
由圖3可知，Z3菌株與植物乳桿菌NBRC 15891（Gen Bank登錄號(hào)：NR 113338.1）聚于一枝，親緣關(guān)系最近，證實(shí)該菌株為植物乳桿菌。
2.4不同日齡獺兔胃腸道中乳酸菌的相對(duì)含量
由表3可知，Z3等乳酸菌廣泛定植于不同日齡獺兔的胃腸道中，相對(duì)水平總體以胃<小腸<大腸的趨勢(shì)提升；隨著獺兔日齡的增長(zhǎng)，乳酸菌在胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸中的相對(duì)水平也顯著升高（P<0.05）。
3討論
乳酸菌多附殖在動(dòng)物腸道上皮，可產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，降低腸道的pH，抑制致病菌的繁殖，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)；也可通過(guò)分泌胞外多糖、γ-氨基丁酸等產(chǎn)物，減少血脂與膽固醇的含量，與腸道上皮屏障相互作用提升宿主的免疫力與生長(zhǎng)性能。
乳酸菌作為微生物制劑，替抗價(jià)值較為理想，試驗(yàn)條件下提升兔生產(chǎn)性能與免疫水平、改善腸道環(huán)境的效果顯著。但獺兔乳酸菌補(bǔ)充劑的制備受以下條件制約：（1）外源補(bǔ)充乳酸菌對(duì)外界儲(chǔ)存環(huán)境的耐受性差；（2）異源乳酸菌無(wú)法長(zhǎng)久生存于宿主腸道中；（3）對(duì)獺兔養(yǎng)殖有利的乳酸菌研究較少。
本試驗(yàn)從獺兔胃腸道中分離出的糞腸球菌、短乳桿菌、空腸腸球菌和植物乳桿菌是《飼料添加劑品種目錄（2013）》中允許的微生物添加劑，在豬、禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果出色，在獺兔胃腸道中普遍分布，有待進(jìn)一步分析該菌株對(duì)獺兔腹瀉與生產(chǎn)性能的影響。
4結(jié)論
從獺兔胃腸道內(nèi)容物中分離并純化得到糞腸球菌、短乳桿菌、空腸腸球菌和植物乳桿菌，所檢乳酸菌在獺兔胃腸道中的相對(duì)水平在不同日齡獺兔胃腸道普遍分布，隨獺兔日齡的增長(zhǎng)而升高。
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