摘要哈茨木霉菌是一種重要的生防菌，灰葡萄孢菌是番茄灰霉病的病原菌，通過對峙試驗研究哈芡木霉菌對灰葡萄孢菌的抑制作用。結(jié)果表明，該哈茨木霉菌在室內(nèi)能夠很好地抑制灰葡萄孢菌的生長。哈茨木霉菌的培養(yǎng)采用固液雙相培養(yǎng)的方法，用正交試驗優(yōu)化法分別對液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基進行優(yōu)化。結(jié)果表明，該哈茨木霉菌在優(yōu)化好的固液雙相培養(yǎng)基上能產(chǎn)生5.6×109個孢子。
番茄灰霉病是危害番茄的主要病害之一，該致病菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers），能夠侵染番茄葉片、莖和青果等植株地上部分，發(fā)病嚴重時會造成大量爛花、爛果，直接影響產(chǎn)量。木霉菌作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面等生態(tài)環(huán)境中，具有適應(yīng)性強、存在范圍廣和廣譜、高效等優(yōu)點。哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）是木霉菌中應(yīng)用最早、最廣的一個菌種，可以用于預(yù)防由腐霉菌、立枯絲核菌、鐮刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害。
哈茨木霉孢子耐受性強，易于加工成制劑，是一類重要的生防真菌，其真菌孢子培養(yǎng)主要采用固體發(fā)酵。固體發(fā)酵雖然操作簡單，但易受雜菌污染，產(chǎn)生孢子低，發(fā)酵時間長，經(jīng)濟效率低。目前，主要采用先用液體發(fā)酵產(chǎn)生菌絲，再將菌液接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)生孢子的固液雙相發(fā)酵培養(yǎng)模式。正交試驗優(yōu)化法是優(yōu)化培養(yǎng)基常用的方法。因此，采用正交試驗優(yōu)化法對哈茨木霉的培養(yǎng)進行初步優(yōu)化，為其在生防中的應(yīng)用提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗材料與儀器
供試菌種為哈茨木霉菌、番茄灰葡萄孢菌，由河南省生物農(nóng)藥工程研究中心分離獲得；試驗儀器有恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、冰箱；試劑有葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、NaCl、NaOH、HCl；培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
1.2試驗方法
1.2.1哈茨木霉菌對番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。平板對峙培養(yǎng)是研究生防菌效價最常用的方法之一，該方法操作簡單，能直接觀察抑制效果，因而本試驗采用平板對峙培養(yǎng)測定哈茨木霉菌對番茄灰葡萄孢菌的抑制效果。具體操作如下：在PDA培養(yǎng)基中心位置接種直徑為6 mm的番茄灰葡萄孢菌菌餅，距離平板中心兩側(cè)2 cm處，分別接種一塊直徑為6 mm的哈茨木霉菌菌餅，以只接種番茄灰葡萄孢菌菌餅為對照，28℃恒溫培養(yǎng)6～9 d后，與對照對比，觀察記載哈茨木霉菌對番茄灰葡萄孢菌的抑制情況，每組處理3次重復(fù)。
1.2.2哈茨木霉菌培養(yǎng)基優(yōu)化。
（1）液體培養(yǎng)基優(yōu)化。取制好的哈茨木霉菌孢子種子液（濃度為108 cfu/mL），按1%接種量分別接種于不同處理的液體培養(yǎng)基中，采用4因素3水平正交試驗對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，正交試驗的因素與水平設(shè)計見表1。培養(yǎng)條件為25℃，搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，7 d后過濾菌絲，80℃烘干并稱量菌絲干重。每個處理3次重復(fù)。
（2）固體培養(yǎng)基優(yōu)化。取培養(yǎng)7 d的哈茨木霉菌菌絲懸浮液種子液（菌絲干重約為0.002 g/mL）按20%接種量分別接種于不同處理的固體蛭石培養(yǎng)基中，采用4因素3水平正交試驗對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，正交試驗的因素與水平設(shè)計見表2。培養(yǎng)條件為25℃，培養(yǎng)5 d，5 d后采用血球計數(shù)板法計算孢子數(shù)目。
2結(jié)果與分析
2.1哈茨木霉菌對番茄灰葡萄孢菌的抑制作用
由圖1可知，茨木霉菌在室內(nèi)對番茄灰葡萄孢菌有很好的抑制效果。哈茨木霉菌在PDA培養(yǎng)基上長勢迅速，第3天哈茨木霉菌就表現(xiàn)出對番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。對峙試驗第5天時，可以明顯看出哈茨木霉菌繼續(xù)生長，占據(jù)整個培養(yǎng)皿，番茄灰葡萄孢菌菌絲出現(xiàn)濃縮、消解等現(xiàn)象。在顯微鏡觀察下，哈茨木霉菌菌絲入侵番茄灰葡萄孢菌菌落，番茄灰霉菌絲出現(xiàn)斷裂。隨著培養(yǎng)時間的延長，最終番茄灰霉病菌完全被抑制，直至死亡消失。
2.2哈茨木霉菌的培養(yǎng)基優(yōu)化
2.2.1液體培養(yǎng)基優(yōu)化。將哈茨木霉菌孢子接種到表1中配方水平的培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后，稱量菌絲干重，結(jié)果見表3?？梢钥闯?，該哈茨木霉菌液體培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖1.5%、（NH4）2SO4 0.25%、酵母粉4%、花生餅粉4%。endprint
2.2.2固體培養(yǎng)基優(yōu)化。將哈茨木霉菌菌絲接種到表2的固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后，通過血球計數(shù)板計數(shù)，結(jié)果見表4?？梢钥闯觯摴哪久咕后w培養(yǎng)基最優(yōu)組合為葡萄糖1.5%、酵母粉2%、花生餅粉4%、麥麩6%。
3結(jié)論與討論
哈茨木霉菌是一種重要的生防菌，能夠抑制多種植物病原菌生長。平板對峙試驗表明，哈茨木霉菌能夠很好地抑制番茄灰霉病菌生長。以往研究多側(cè)重于哈茨木霉菌菌絲的生長，但菌絲不易于保存及應(yīng)用，加工成制劑困難。國外已有商品化的哈茨木霉菌成品，多數(shù)是孢子制劑。本試驗哈茨木霉菌在優(yōu)化的固液雙向培養(yǎng)基上能產(chǎn)生5.6×109個孢子，方便加工成制劑及運輸。
本試驗僅限于室內(nèi)平板培養(yǎng)，對于該哈茨木霉菌在大田生產(chǎn)上是否具有良好的防效有待于進一步研究。哈茨木霉菌的孢子具有抗性強、耐儲存、方便運輸?shù)忍攸c，液體發(fā)酵生產(chǎn)出較多菌絲，固體發(fā)酵易受雜菌的污染，產(chǎn)生孢子低，發(fā)酵時間長，因而采用固液雙相發(fā)酵的方法是一種不錯的選擇。正交優(yōu)化初步對哈茨木霉菌培養(yǎng)基進行優(yōu)化，哈茨木霉菌產(chǎn)生孢子受光照、溫度等很多條件的影響，下一步需要通過正交優(yōu)化或者響應(yīng)面法進一步深度優(yōu)化。
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