2結(jié)果與討論
2.1富集聚球藻的主要類群
流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，富集樣品主要為富含PC的聚球藻(圖1)。高通量測序共測得269 977條序列，在97%的相似度下，共獲得295個OTUs，其中OTU183為優(yōu)勢度最高的類群。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，富集聚球藻以5.1亞類的cladeⅧ型為主，相似序列均分離自近海海域的浮游生物樣本。
圖1富集樣本B12和H19的流式細(xì)胞熒光信號圖以及系統(tǒng)進(jìn)化樹
注:*表示該OTU在樣品中的相對豐度。B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本
聚球藻作為中國近海浮游植物的主要類群，種群多樣性豐富，按系統(tǒng)發(fā)育組成可分為Subcluster 5.1、5.2和5.3三個大的亞類，包含至少20多個分支，按捕光色素蛋白組成可分為富含PC型和富含PE型的聚球藻。結(jié)果顯示，聚球藻富集樣本B12和H19樣品間種群結(jié)構(gòu)差異不明顯，原位聚球藻經(jīng)富集培養(yǎng)后種群趨于單一化。富含PE的聚球藻在硝酸鹽濃度較高的環(huán)境中處于競爭劣勢，因此在培養(yǎng)過程中其相對豐度降低，PC型聚球藻成為主要類群。聚球藻系統(tǒng)進(jìn)化分析歸類的cladeⅧ型是隸屬于Subcluster 5.1的一類富含PC的聚球藻，對鹽度和營養(yǎng)鹽變化有較高的適應(yīng)性，在河口區(qū)域的相對豐度遠(yuǎn)高于外海。
2.2不同硝酸鹽濃度對聚球藻生長的影響
富集培養(yǎng)的聚球藻接種至改良的SNAX培養(yǎng)基中，聚球藻無適應(yīng)期，快速進(jìn)入對數(shù)生長期，且比生長速率迅速達(dá)到最大值(圖2)。對數(shù)生長期時，不同硝酸鹽濃度實驗組間的聚球藻細(xì)胞生物量差異不大;對數(shù)生長期后，聚球藻細(xì)胞密度隨硝酸鹽濃度的增高而逐漸增高。當(dāng)硝酸鹽濃度為0.1、1.0、10.0μmol·L–1時，聚球藻培養(yǎng)體系所能支持的生物量較小且差異不顯著。聚球藻細(xì)胞在對數(shù)生長期達(dá)到一定豐度后，細(xì)胞豐度不再增長，最高細(xì)胞密度為4.49×106 cells·mL–1。當(dāng)硝酸鹽濃度為100.0μmol·L–1時，聚球藻培養(yǎng)體系可支持的生物量更大，聚球藻細(xì)胞可持續(xù)增長直至穩(wěn)定，最高細(xì)胞密度為1.35×107 cells·mL–1。不同硝酸鹽濃度下，B12和H19聚球藻的生長特性存在差異，B12的對數(shù)生長期持續(xù)時間均少于H19。
圖2不同硝酸鹽濃度下聚球藻細(xì)胞密度以及最大比生長速率
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
高硝酸鹽濃度可以支持的聚球藻生物量更大。在藻類生長初期，硝酸鹽并不會成為藻類生長的限制因子;隨著聚球藻的生長，硝酸鹽濃度為0.1、1.0、10.0μmol·L–1的實驗組氮源不足，藻細(xì)胞通過內(nèi)源呼吸維持自身代謝和光合作用，藻細(xì)胞生長受到限制;而100.0μmol·L–1硝酸鹽可提供給聚球藻細(xì)胞更多的營養(yǎng)，從而細(xì)胞不斷增殖，達(dá)到穩(wěn)定。實驗采用了半連續(xù)培養(yǎng)方式，聚球藻細(xì)胞未呈現(xiàn)明顯的衰亡期。聚球藻對不同硝酸鹽濃度具有較強的適應(yīng)性，但不同硝酸鹽濃度組間生長狀況存在較大差異，這主要是由其對硝酸鹽吸收能力的不同引起。已有研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，聚球藻在較高硝酸鹽濃度下，生長會出現(xiàn)延遲效應(yīng)，硝酸鹽濃度由5μmol·L–1升高至156μmol·L–1時，其半飽和常數(shù)由較低水平(0.1~8μmol·L–1)提高至較高水平(1~156μmol·L–1)。聚球藻對硝酸鹽濃度變化的迅速適應(yīng)，可促使其在硝酸鹽濃度波動較大的近海環(huán)境中細(xì)胞穩(wěn)定增殖，獲得相較于原綠球藻的競爭優(yōu)勢。
2.3不同硝酸鹽濃度對聚球藻色素含量的影響
隨著硝酸鹽濃度的增高，聚球藻的Chl a濃度逐漸增高，藻膽蛋白含量無明顯變化(圖3)。以第15 d聚球藻藻細(xì)胞數(shù)計算單位細(xì)胞內(nèi)的Chl a和藻膽蛋白含量，發(fā)現(xiàn)硝酸鹽濃度升高對單位藻細(xì)胞內(nèi)的Chl a累積無明顯影響，但藻膽蛋白含量降低。當(dāng)硝酸鹽濃度為100.0μmol·L–1時，單位細(xì)胞內(nèi)PC、PE和APC的含量最低，分別為0.779 pg·cell–1、1.002 pg·cell–1、0.726 pg·cell–1。同一硝酸鹽濃度下，H19的Chl a含量顯著高于B12(P<0.05)。在1.0μmol·L–1硝酸鹽濃度下，B12樣本的藻膽蛋白含量低于檢出限。
圖3不同硝酸鹽濃度下聚球藻總?cè)~綠素a、藻膽蛋白的濃度
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
Chl a作為一種光合色素，在光合作用中起到捕獲光能的作用，能有效吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能，驅(qū)動有機碳轉(zhuǎn)化為無機碳，是光能轉(zhuǎn)化效率的重要表征參數(shù)。硝酸鹽主要是利用光合作用中的H2O氧化形成O2的過程中釋放的ATP進(jìn)入細(xì)胞。隨著硝酸鹽濃度的增加，光能轉(zhuǎn)化效率逐漸提高，光合作用增強，從而產(chǎn)生更多的ATP，促使更多的硝酸鹽主動輸入細(xì)胞，形成一種正反饋機制，有助于聚球藻將更多的光能轉(zhuǎn)化為自身化學(xué)能，從而提高其初級生產(chǎn)力。除了Chl a，聚球藻還可利用藻膽體捕獲和傳遞光能。氮是聚球藻藻膽蛋白的重要組成元素，直接影響藻膽體的合成。有研究表明，微藻主要通過調(diào)配用于氮固定和色素合成的能量，平衡氮缺乏的不利影響。高硝酸鹽濃度下，聚球藻細(xì)胞密度較大，用于氮固定的能量較多，而用于藻膽蛋白合成的能量較少。這也是不同硝酸鹽濃度下藻膽蛋白含量差異不大的主要原因。另外高硝酸鹽濃度下，聚球藻細(xì)胞密度變大的同時，細(xì)胞間的遮光效應(yīng)增強，單位細(xì)胞的捕光能力受到一定抑制。
2.4不同硝酸鹽濃度對聚球藻光合生理參數(shù)的影響
不同硝酸鹽濃度對B12和H19的Fv/Fm的影響不同。B12各組間的Fv/Fm無顯著差異(P>0.05)，而H19的Fv/Fm隨硝酸鹽濃度的增大而逐漸減小(P<0.05)(圖4)。當(dāng)硝酸鹽濃度為100.0μmol·L–1時，H19的Fv/Fm值與濃度為0.1μmol·L–1時相比，減少了43.27%，表明在高硝酸鹽濃度的環(huán)境中，聚球藻H19所捕獲的光能超過自身可利用的能力，光合作用受到的脅迫增大。不同濃度的硝酸鹽對兩種聚球藻富集樣本的Qy影響不顯著。
圖4不同硝酸鹽濃度下聚球藻的光合生理參數(shù)
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
Fv/Fm和Qy分別表示PSII的最大光化學(xué)效率和熒光量子產(chǎn)率，能夠反映環(huán)境條件對藻細(xì)胞光合作用的脅迫。一般認(rèn)為，硝酸鹽可以通過其中間產(chǎn)物亞硝酸鹽抑制植物光合作用。高濃度硝酸鹽下，細(xì)胞膜內(nèi)的質(zhì)子通透性通常高于細(xì)胞膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度，從而導(dǎo)致光合作用所受到的脅迫增大。Sahay等和Chen等發(fā)現(xiàn)高亞硝酸鹽濃度可抑制光合作用中心的電子傳遞速率和葉綠體產(chǎn)氧速率，使藻細(xì)胞的Fv/Fm值降低。
2.5不同硝酸鹽濃度下培養(yǎng)體系中的營養(yǎng)鹽及碳氮含量的變化
隨著培養(yǎng)條件中硝酸鹽濃度的增高，培養(yǎng)結(jié)束后H19的NO3-和PO43-的濃度逐漸降低(圖5)。同時，當(dāng)硝酸鹽濃度為100.0μmol·L–1時，培養(yǎng)體系內(nèi)的TIC和TOC的濃度較低，分別為9.96 mg·L–1和7.08 mg·L–1，TN的濃度無顯著差異(P>0.05)(圖6)。以第15 d培養(yǎng)體系中聚球藻藻細(xì)胞數(shù)計算單位細(xì)胞釋放的TIC、TOC和TN含量，分別為0.68 mg·cell–1、0.48 mg·cell–1和1.55 mg·cell–1。結(jié)果表明隨著硝酸鹽濃度的增高，藻體利用氮和磷的生理反應(yīng)會加快，對氮和磷的同化率會略有升高，導(dǎo)致其培養(yǎng)體系中測得的氮和磷營養(yǎng)鹽濃度較低。雖然高硝酸鹽濃度能夠促進(jìn)聚球藻對氮和磷的轉(zhuǎn)化速率，但是培養(yǎng)體系中的總有機碳含量并沒有顯著提高，聚球藻生物量的增加主要提高了食物鏈的底層供給，對于溶解有機碳的輸出影響較小。在實際海域，固碳并不等于儲碳，有機物的過量可能導(dǎo)致大量細(xì)菌滋生，從而將浮游植物固定的有機碳再次釋放入大氣中，同時消耗大量氧氣，使生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)入惡性循環(huán)。因此，適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)鹽濃度將有助于避免富營養(yǎng)化并促進(jìn)浮游植物生長，提高生物泵效率從而保持較高的儲碳能力。
圖5不同硝酸鹽濃度下聚球藻培養(yǎng)體系中NH4+、NO3–、NO2–和PO43–濃度
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
圖6不同硝酸鹽濃度下聚球藻培養(yǎng)體系中的TIC、TOC和TN濃度
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
氮是影響微藻生長的重要因素。過低的氮濃度會影響微藻細(xì)胞的三羧酸循環(huán)及葉綠素合成，降低其光合效率，而過高的氮濃度會導(dǎo)致微藻細(xì)胞中毒，生長受到抑制。已有研究表明，氮添加可促進(jìn)浮游植物凈生長率的增加，但PSII光合作用參數(shù)Fv/Fm和σPSII與氮添加并無直接關(guān)系;氮缺乏條件下微藻生理水平上的響應(yīng)與光照過量相似，會發(fā)生光合色素降解光合能力下降的現(xiàn)象，而代謝水平上合成胞外聚合物的能力會增強進(jìn)而影響藻際環(huán)境微生物的豐度。硝酸鹽的同化主要依靠活性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(NRT)，硝酸還原酶(NR)和亞硝酸鹽還原酶(NiR)。其中，NRT主要負(fù)責(zé)將硝酸鹽輸送入細(xì)胞，NR和NiR促進(jìn)硝酸鹽還原為銨。當(dāng)硝酸鹽濃度較高時，NRT、NR和NiR基因的表達(dá)量較高，從而促進(jìn)硝酸鹽的同化。聚球藻在全球海洋中數(shù)量巨大、分布廣泛且周轉(zhuǎn)迅速(相當(dāng)于海洋中浮游植物的五倍)，是海洋異養(yǎng)生物的主要食物來源之一，同時也為異養(yǎng)細(xì)菌提供了重要碳源和營養(yǎng)源。高濃度的硝酸鹽可促進(jìn)海洋中的聚球藻增殖，提升氮磷同化速率，提高底營養(yǎng)級的供給。但本研究也存在一定的局限性。富集樣品的聚球藻種群趨于同質(zhì)化，與實際海域原位聚球藻有差異，主要原因是富集培養(yǎng)條件過于單一，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽濃度較高，導(dǎo)致聚球藻中的機會類群迅速適應(yīng)成為絕對優(yōu)勢種。B12和H19以rpoC1為標(biāo)記的種群組成差異不大，優(yōu)勢種均為OTU183，但實驗結(jié)果中兩者對硝酸鹽的響應(yīng)在生長特性、光合參數(shù)方面存在較大的差異，主要由聚球藻在原海域生態(tài)位中水平轉(zhuǎn)移造成的適應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)入引起。另外培養(yǎng)實驗的“瓶頸效應(yīng)”也會影響浮游植物響應(yīng)特征。在30 mL至4 L的容積范圍內(nèi)，培養(yǎng)瓶容積對浮游植物生長有顯著影響。采用圍隔開展原位培養(yǎng)實驗將有助于進(jìn)一步探究不同硝酸鹽濃度對聚球藻種群的影響。
3結(jié)論
通過研究不同硝酸鹽濃度下聚球藻的生長趨勢、光合色素含量、光合生理參數(shù)以及培養(yǎng)體系中碳氮含量的變化，發(fā)現(xiàn)聚球藻對硝酸鹽濃度具有較高的適應(yīng)能力。聚球藻在不同硝酸鹽濃度下均能實現(xiàn)生長，當(dāng)硝酸鹽濃度較高時，聚球藻培養(yǎng)體系可支持的生物量顯著提高，且對光能的轉(zhuǎn)化效率更高，光合作用更強。光合作用產(chǎn)生的能量促進(jìn)了聚球藻對硝酸鹽以及碳、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，但其捕獲的光能超過自身可利用的能力，導(dǎo)致其光合效率降低。研究結(jié)果證實高硝酸鹽濃度能夠促進(jìn)聚球藻將更多的光能固定為自身化學(xué)能，提高氮、磷在海洋食物鏈的吸收轉(zhuǎn)化，然而其產(chǎn)生增量的效率較低，對浮游生態(tài)系統(tǒng)的儲碳促進(jìn)作用相對較小。
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